王 豪，郭本恒，王蔭榆，吳正鈞

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海200436）

具有抑制單胺氧化酶活性的干酪乳桿菌JH-23生長特性及生理功能研究

王 豪1，郭本恒2，*，王蔭榆2，吳正鈞2

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306；2.光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海200436）

以具有體外抑制單胺氧化酶作用的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）JH-23作為研究對象，考察了其部分生長特性和生理功能。L.casei JH-23屬于厭氧型的革蘭氏陽性桿菌，無芽孢。該株菌的最適生長溫度為37℃，最適生長pH為6.0，最適接種量為3%，MRS中24h培養(yǎng)結(jié)束后活菌數(shù)可達1.11×109cfu/mL，在脫脂乳中具有良好的保藏性能。生理功能實驗顯示，L.casei JH-23在pH為3.0的環(huán)境下生長3h后存活率可達到65.32%，對酸性環(huán)境有較強的耐受性；最高膽鹽耐受濃度為0.5%，最高NaCl耐受濃度為6%，這些結(jié)果表明，L.casei JH-23作為益生菌有著很好的工業(yè)應(yīng)用價值和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

干酪乳桿菌JH-23，生長特性，生理功能

益生菌是一類通過改變宿主某一部位菌群的組成，從而產(chǎn)生有利于宿主健康作用的單一或組成明確的混合微生物。益生作用則是指某種微生物制劑或發(fā)酵制品通過調(diào)節(jié)宿主黏膜與系統(tǒng)免疫功能以及改善腸道營養(yǎng)與菌群平衡對宿主所產(chǎn)生的有益的生理作用［1］，益生作用的范圍可分為營養(yǎng)、生理作用和抗菌作用。鑒于益生菌眾多的功能性作用，目前已將其應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)，主要的益生菌有雙歧桿菌和乳桿菌等。近年來關(guān)于益生菌降血脂、抗高血壓、降膽固醇等功能性作用已得到證實，但對于益生菌的抗衰老作用研究的很少。前期實驗中篩選出一株具有抑制單胺氧化酶活性的干酪乳桿菌JH-23，單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO，EC 1.4.3.4）在機體內(nèi)的主要功能是催化內(nèi)源性和外源性單胺類物質(zhì)的代謝。人體中MAO的含量從45歲起隨年齡的增加而急劇增加，被認(rèn)為是老化的標(biāo)志，又稱之為老化相關(guān)酶，該酶活性的不斷升高會引起整個機體逐步衰老［2］。據(jù)報道，帕金森病、老年癡呆病以及近年來都市中較為流行的抑郁癥等病理性衰老疾病均與MAO活性異常有關(guān)［3-4］，說明MAO與衰老有密切關(guān)系。MAO直接涉及到了人體的衰老過程，其含量與年齡的增加成正相關(guān)，是衰老的特征指標(biāo)，因此篩選出的MAO抑制劑意味著有潛在的抗衰老作用。有鑒于此，具有抑制MAO活性的干酪乳桿菌JH-23將來可能會應(yīng)用到食品特別是乳品中，開發(fā)輔助抗衰老作用的功能性乳制品，以滿足人們健康的需要。所以有必要對該干酪乳桿菌的一些生長特性和生理功能進行研究，從而更好地了解該益生菌的特性。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

菌種 前期實驗篩選并鑒定得到的干酪乳桿菌JH-23；?；悄懰徕c Sigma公司；溴甲酚紫 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；MRS固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基 Merck公司；其它為實驗室常規(guī)分析純化學(xué)試劑。

Avanti J30I高速冷凍離心機 Beckman Coulter公司；TH-CB-402型超凈工作臺 LABCONCO公司；厭氧培養(yǎng)箱 英國RUSKINN TECHNOLOGY LIMITED公司；PHS-25型pH計 奧立龍公司；恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SPECORD 205型紫外分光光度計 德國耶拿公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株生長特性研究

1.2.1.1 菌落和菌體形態(tài)以及液體培養(yǎng)特征觀察L.casei JH-23在MRS平板劃線分離，37℃厭氧培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)；同時按1%接種量接到MRS液體中，37℃培養(yǎng)24h，觀察液體生長情況。接種環(huán)挑取6h培養(yǎng)液到載玻片涂片，革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌體形態(tài)并攝影記錄。

1.2.1.2 菌株最適生長溫度和最適生長pH的測定［5］L.casei JH-23按1%接種量接入MRS-broth，放置于不同溫度（25、30、34、37、40、45℃）培養(yǎng)16h，以沒有接種的培養(yǎng)基作參比，于620nm測定培養(yǎng)液的光密度值，依據(jù)光密度的大小確定最適生長溫度。

同時接種JH-23到不同pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）的MRS液體培養(yǎng)基中，在最適溫度下培養(yǎng)16h，以沒有接種的同pH液體培養(yǎng)基作參比，于620nm測定培養(yǎng)液的光密度值，依據(jù)光密度的大小確定最適生長pH。

1.2.1.3 菌株生長最適接種量的測定 以接種量（1%、3%、5%、7%、9%）將種子液接入MRS-broth中，37℃靜置培養(yǎng)16h后，采用傾注平板法進行活菌計數(shù)，以活菌數(shù)作為最適接種量的指標(biāo)。

1.2.1.4 菌株產(chǎn)酸能力檢驗和生長曲線的繪制［6］活化好的菌株JH-23按1%接種量接于200mL MRS培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，每隔2h測定培養(yǎng)液中的活菌數(shù)和pH。發(fā)酵液pH用pH計測定，活菌數(shù)采用平板計數(shù)法，以活菌數(shù)對數(shù)值和pH對時間作圖，得到菌株的生長曲線。

1.2.1.5 菌株保藏特性研究方法 L.casei JH-23按1%量接入MRS液體，收集到達對數(shù)生長期末的菌液，一部分以MRS發(fā)酵原液形式放入冰箱4℃保存；另一部分3000×g，4℃離心15min收集菌體，無菌水洗滌兩次，菌體懸浮在10%的SKM中，放入冰箱4℃保存。采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，在第0、7、14、21d分別對兩種保藏液體中的活菌計數(shù)。

1.2.2 菌株生理功能研究

1.2.2.1 菌株耐酸能力測定［7］L.casei JH-23按1%接種量接入MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)液3000×g，4℃離心15min收集菌體，收集的菌體用滅菌的生理鹽水洗滌3遍。之后菌體分別懸浮于pH為2.0、3.0、4.0和5.0的MRS液體培養(yǎng)基中，以pH為5.7±0.2的MRS液體培養(yǎng)基為常規(guī)對照，37℃培養(yǎng)3h，測定存活率。

1.2.2.2 菌株膽鹽耐受能力的測定［8］將活化的菌株按1%的接種量接種于含不同濃度?；悄懰徕c（TCA）的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，于0h和16h分別測定OD620，計算兩者差值；同時在不同TCA濃度的MRS瓊脂平板上劃線，37℃厭氧培養(yǎng)48h后觀察生長情況。

1.2.2.3 菌株對NaCl耐受性的測定［9］在MRS液體管中加入NaCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、2%、4%、6%、8%、9%、10%、11%），滅菌后接種，37℃厭氧培養(yǎng)，以溴甲酚紫為指示劑，觀察培養(yǎng)基顏色變化和菌體生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株生長特性研究

2.1.1 L.casei JH-23菌落和菌體形態(tài)以及液體培養(yǎng)特征觀察 L.casei JH-23在MRS平板上劃線分離，其菌落形態(tài)如圖1-A所示：菌落直徑為0.3～2mm，圓形，邊緣整齊，正面凸起，乳白色，不透明，表面濕潤光滑。JH-23為G+，桿狀細(xì)菌，不產(chǎn)芽孢，菌體大小為0.4～1.0μm寬，2～8μm長，具體的菌體形態(tài)如圖1-B。

L.casei JH-23在液體MRS中培養(yǎng)，4h左右培養(yǎng)液開始渾濁并伴有菌體細(xì)胞沉淀物產(chǎn)生，12h左右生長物均勻渾濁，輕輕搖動沒有氣泡產(chǎn)生，16h有大量菌體沉淀，沉淀結(jié)構(gòu)疏松，24h乳白色沉淀明顯。

圖1 JH-23的菌落和菌體形態(tài)

2.1.2 L.casei JH-23的最適生長溫度 確定菌株在不同溫度下的生長情況對于其保存和處理具有指導(dǎo)意義，L.casei JH-23的最適生長溫度如圖2所示。

從圖2中可以看出，L.casei JH-23在25℃及45℃時生長緩慢，30～40℃間生長較好，該菌株的最適生長溫度為 37℃，與一般乳酸菌的最適溫度相似［10］。

2.1.3 L.casei JH-23的最適生長 pH 將 L.casei JH-23接種到不同起始pH的MRS液體試管中，37℃靜置培養(yǎng)，測定菌株在不同pH條件下培養(yǎng)16h的OD620，結(jié)果如圖3。

圖2 L.casei JH-23的最適生長溫度

圖3 L.casei JH-23的最適生長pH

從圖3可以看出，L.casei JH-23在pH4.0至10.0的范圍均可生長，其最適生長pH為6.0。

2.1.4 L.casei JH-23的生長最適接種量 圖4顯示，按3%（v/v）接種量將L.casei JH-23接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)16h，活菌數(shù)可達到1.18× 109cfu/mL。相對于其它接種量而言，3%接種量所得到的發(fā)酵液中活菌數(shù)最多，即最適接種量為3%。

圖4 L.casei JH-23的最適接種量

2.1.5 L.casei JH-23生長曲線的測定 菌株的生長過程可以通過細(xì)胞數(shù)的測定和培養(yǎng)基pH變化來反映，其比較直觀地體現(xiàn)出乳酸菌在一定條件下的群體生長規(guī)律。

按上述實驗結(jié)果，將活化好的L.casei JH-23按3%（V/V）的接種量接入MRS-broth培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔2h取樣測定其發(fā)酵液中的活菌數(shù)量和pH，得到如圖5的生長曲線。

圖5顯示，在MRS培養(yǎng)基中，JH-23在2h進入對數(shù)生長期，12h左右進入穩(wěn)定期。進入穩(wěn)定期前，隨著培養(yǎng)時間的增加，pH不斷降低。進入穩(wěn)定期后，pH下降趨勢漸緩。說明穩(wěn)定期JH-23仍在生長，只是生長和死亡形成動態(tài)平衡［11］，24h培養(yǎng)結(jié)束，pH為3.70，培養(yǎng)液中 JH-23活菌濃度為 1.01× 109cfu/mL。

2.1.6 L.casei JH-23在4℃的保藏特性 在4℃保藏過程中，于第0、7、14、21d分別測定菌株在MRS和 SKM中的活菌數(shù)，以log10活菌數(shù)對天數(shù)（d）作圖，如圖6得到L.casei JH-23在4℃的保藏特性曲線。

圖5 L.casei JH-23在MRS中的生長曲線

圖6 L.casei JH-23在MRS發(fā)酵液（A）和脫脂乳（B）中的保藏曲線

從圖6可以看出，L.casei JH-23的活菌數(shù)對數(shù)值隨保藏時間的增加呈線性下降，L.casei JH-23在pH 3.7的MRS和pH 6.2的SKM中4℃保藏，活菌數(shù)減少一個數(shù)量級所需時間分別為18.13d和42.76d?？梢?，懸浮L.casei JH-23在中性SKM中，具有良好的保藏性能。

2.2 菌株生理功能研究

2.2.1 L.casei JH-23耐酸性實驗 微生態(tài)制劑經(jīng)口服后首先到達胃，這就要求乳酸菌要具有較強的耐酸能力，才能夠保證一定數(shù)量的活菌順利通過胃酸環(huán)境而到達腸內(nèi)。胃液pH的大小根據(jù)飲食結(jié)構(gòu)不同而波動很大，通常pH為3左右，空腹或食用酸性食品時，pH可達1.5；食用堿性食物時，pH為4～5，且食物（尤其是流體）通過胃的時間相對較短，一般為1～2h［12］。

圖7 L.casei JH-23的耐酸能力

由圖7可見，L.casei JH-23的存活率隨著培養(yǎng)基pH的降低而下降，在pH為3.0的環(huán)境下生長3h后存活率可達到65.35%，pH2.0時雖然有大量活菌死亡，但仍有部分細(xì)菌存活下來，存活率為15.46%，說明該菌株對酸性環(huán)境有較強的耐受力。

2.2.2 L.casei JH-23耐膽汁鹽實驗 微生物對膽鹽的抗性是其能夠在腸道存活、生長并發(fā)揮功效的先決條件之一。牛磺膽酸鈉（TCA）是膽鹽中的主要成分，在此次實驗中作為菌株膽鹽耐受力的指標(biāo)，L.casei JH-23在不同TCA濃度的MRS培養(yǎng)基中的生長情況如表1所示。

表1 L.casei JH-23對不同濃度膽鹽的耐受性（n=3）

人體小腸中膽鹽含量在0.03%～0.3%之間，能夠在正常生理膽鹽濃度中生長和代謝的菌株才可能在腸道轉(zhuǎn)運過程中存活［13］。如表1所示，L.casei JH-23所能耐受MRS中膽鹽的最大濃度為0.5%，較小腸內(nèi)最高膽鹽含量（0.3%）要高，作為益生菌具有較強的膽鹽耐受力。

2.2.3 L.casei JH-23的NaCl耐受性 菌株的NaCl耐受性也是菌株的重要特性之一，其耐受值的高低體現(xiàn)了菌株所能耐受的滲透壓以及在腸道中存活能力的高低，L.casei JH-23的NaCl耐受性如表2所示。

表2 L.casei JH-23菌株在不同NaCl濃度培養(yǎng)基中生長情況

由表2可見，L.casei JH-23在質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于4%的NaCl濃度下生長良好，在6%的濃度下生長一般，而在8%的NaCl濃度下略有生長，NaCl濃度9%以上不生長，所以L.casei JH-23能夠耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的NaCl。

3 結(jié)論

本實驗針對具有體外抑制MAO活性的L.casei JH-23的部分生長特性和生理功能進行了研究。菌株JH-23屬于厭氧型的革蘭氏陽性桿菌，無芽孢。最適生長溫度為37℃，最適生長pH為6.0，最適接種量為3%。MRS培養(yǎng)基比脫脂乳培養(yǎng)基更適合其生長，MRS中 24h培養(yǎng)結(jié)束后活菌數(shù)可達 1.11× 109cfu/mL，但該菌株在脫脂乳中具有更優(yōu)的保藏性能。

L.casei JH-23在pH為3.0的環(huán)境下生長3h后存活率可達到65.32%，對酸性環(huán)境有較強的耐受性，其最高膽鹽耐受濃度為0.5%，最高NaCl耐受濃度為6%，這些結(jié)果表明L.casei JH-23作為益生菌有較好的工業(yè)應(yīng)用價值和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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Study on the growth characteristics and physiological functions of Lactobacillus casei JH-23 having monoamine oxidase-inhibitory effect

WANG Hao1，GUO Ben-heng2，*，WANG Yin-yu2，WU Zheng-jun2
（1.Food College of Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China；2.Technology Center of Bright Dairy Co.，Ltd.，Shanghai 200436，China）

The partial growth characteristics and physiological functions of Lactobacillus casei JH-23 having monoamine oxidase-inhibitory effect were investigated in this study as a research object.The cells were Grampositive，rod-shaped and nonsporeforming.The optimal temperature，pH value and inoculum size of the bacterium were 37℃，6.0 and 3%respectively.The viable cell concentration of L.casei JH-23 could reach 1.11×109cfu/mL in MRS medium after 24h fermentation.ln the skim milk medium，the preservation property of JH-23 was favorable.The experimental results of physiological functions indicated that survival rate of L.casei JH-23 was 65.32%after growing for 3h in pH3.0 circumstance，while JH-23 presented high tolerance towards bile salt and NaCl，namely 0.5%and 6%respectively.lt was revealed that L.casei JH-23 possessed great industrial application value and development potential as a probiotic.

Lactobacillus casei JH-23；growth characteristics；physiological functions

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0168-04

2009-09-27 *通訊聯(lián)系人

王豪（1984-），男，碩士研究生，主要從事乳品微生物研究。

國家科技支撐計劃“十一五”奶業(yè)重大專項（2006BAD04A14）。