江 俊，張 燕，廖小軍，胡小松，孫志健

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

高靜壓鈍化樹莓多酚氧化酶的動力學(xué)分析

江 俊，張 燕*，廖小軍，胡小松，孫志健

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083）

應(yīng)用高靜壓技術(shù)鈍化樹莓中的PPO，以提高樹莓加工產(chǎn)品的新鮮度和附加值。本文研究了高靜壓對樹莓PPO的鈍化效果，并應(yīng)用一級動力學(xué)模型進行分析。研究結(jié)果表明，隨著壓力升高和持壓時間的延長，樹莓PPO的活性逐漸降低，但在低壓短時處理下有激活現(xiàn)象，經(jīng)600MPa，45min處理后樹莓PPO殘存活性為40.976%；高靜壓對樹莓PPO的鈍化過程符合一級動力學(xué)反應(yīng)模型，壓力對酶鈍化反應(yīng)的影響能用Eyring公式分析。隨著壓力升高，反應(yīng)速率常數(shù)（k值）不斷升高，指數(shù)遞減時間（D值）不斷減??；Zp和Va分別為917.431MPa和-6.020cm3/mol。

高靜壓，樹莓，多酚氧化酶，動力學(xué)

樹莓屬薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus）植物，其果實中富含花青素、鞣花酸等大量的酚類物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值，為越來越多的消費者所青睞。但由于樹莓中存在大量的PPO，導(dǎo)致樹莓及其加工制品在貨架期發(fā)生褐變。為了抑制褐變，傳統(tǒng)方法是通過熱加工來鈍化PPO的活性，但是它存在很多缺陷，諸如使產(chǎn)品新鮮度降低、風(fēng)味和質(zhì)地劣變、食品中的營養(yǎng)成分和一些功能性成分遭到破壞等，大大降低產(chǎn)品感官品質(zhì)和市場價值。因此，尋找新的加工方法鈍化樹莓PPO，并減少對其營養(yǎng)物質(zhì)的影響是提高樹莓加工制品品質(zhì)，實現(xiàn)高附加值的有效途徑。高靜壓（High Hydrostatic Pressure，HHP）是目前發(fā)展最為成熟的一種非熱力加工技術(shù)，它克服了熱加工造成的種種弊端［1-2］，具有優(yōu)良的技術(shù)特性。在國外，這一技術(shù)加工的果蔬產(chǎn)品已實現(xiàn)工業(yè)化。因此，應(yīng)用高靜壓技術(shù)加工樹莓是較好的選擇。如上所述，內(nèi)源PPO是影響樹莓加工產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素。目前，國內(nèi)外對高靜壓鈍化PPO的研究也有廣泛的報道。但眾多的研究結(jié)果表明，受到PPO來源的影響，高靜壓對不同來源的PPO的鈍化效果不盡相同，前人對草莓［3］、香蕉［4］、辣椒［5］、荔枝［6］、鱷梨［7］等果蔬進行高靜壓處理，其中的PPO被有效的鈍化；而蘑菇［8-9］、葡萄［10-11］來源的 PPO對高壓的耐受能力較強，不易被高壓鈍化。高靜壓對樹莓PPO鈍化的研究還未見相關(guān)報道，因此需要開展一些基本的實驗研究，以利于將高靜壓技術(shù)應(yīng)用于樹莓的加工。本文通過研究高靜壓對樹莓PPO的鈍化效果，分析高靜壓鈍化樹莓PPO的動力學(xué)，以獲得系統(tǒng)的數(shù)據(jù)，探知高靜壓鈍化樹莓PPO活性變化的規(guī)律，以改善樹莓產(chǎn)品的顏色品質(zhì)，提高其商品競爭力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

速凍紅樹莓（Rubus idaeus L.，Heritage variety）購于北京東方夏都樹莓科技發(fā)展有限公司，冷鏈運輸，到達后立即避光貯藏于-18℃；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯二酚、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylploypyrolidone，PVPP） 均為分析純，購自北京藍弋化學(xué)試劑公司；鋁箔袋 購于北京華盾塑料公司。

EY-300A分析天平 日本松下電器；奧立龍868型pH計 美國奧立龍公司；ZHJ-308A1榨汁機煙臺福山歐克電氣用品公司；Hitachi himac CR21G高速離心機 日本日立公司；真空封口機 北京市瑞明星包裝機械有限公司；Cary 50紫外分光光度計（帶控溫裝置以及磁力攪拌裝置） 美國瓦里安公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試樣制備 配制含4%的聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）（w/v）的磷酸緩沖液（0.2mol/L的，pH=6.5）作為酶提取液。

稱取樹莓凍果250g，0℃解凍。加入250mL酶提取液，用榨汁機組織搗碎2min后，0～4℃下靜置4h，23000g，4℃離心20min，上清液即為PPO粗提液。將粗提液按5mL的量分裝于阻氣防水耐壓耐低溫的鋁箔袋中，立即放于-80℃超低溫冰箱冷凍，待PPO粗提液中心溫度達到-80℃后，迅速真空封口并迅速放回-80℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2 PPO酶活測定方法 PPO活性的測定采用分光光度法，反應(yīng)底物為0.1mol/L的鄰苯二酚溶液（pH=6.5）。30℃保溫10min后，加入0.5mL樹莓PPO粗酶液，立即在420nm處測定吸光值隨時間的變化曲線，測定時間為15min，掃描時間間隔為0.1s，曲線直線部分的斜率即為酶活。

1.3 實驗方案

設(shè)計壓力梯度為 100、200、300、400、500、600MPa，時間梯度為5、15、25、35、45min。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.4.1 酶活計算公式

表示1mL樹莓粗酶液與過量底物反應(yīng)420nm處吸光值的變化速率（ΔA420nm/min·mL）。

1.4.2 動力學(xué)分析 酶鈍化過程應(yīng)用一級反應(yīng)動力學(xué)公式分析［3，12］：

At為處理tmin后殘存的酶活，A0為初始酶活，k值（min-1）是在設(shè)定的壓力和溫度下的反應(yīng)速率常數(shù)，D值（Decimal reduction time）是指數(shù)遞減時間（min），即在設(shè)定的壓力和溫度下酶活降低一個對數(shù)（90%）所需要的時間。

ZP表示D值對壓力的敏感性，即D值變化一個對數(shù)時對應(yīng)的壓力的變化。P1和P2表示D1和D2對應(yīng)的壓力。

評價壓力對反應(yīng)速率常數(shù)k的影響用Eyring公式（式 6）分析［13］，具體表現(xiàn)為活化體積（Va，cm3/mol）值的大小。其中P2和P1表示對應(yīng)k1和k2的壓力；RP是常數(shù)，為8.314J/（K·mol）。從公式6可以看出，Va可以從失活反應(yīng)速率常數(shù)的自然對數(shù)ln（k）與壓力P作圖所得回歸線的斜率中求得。

1.4.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析采用方差分析（Analysis of variance，ANOVA）；使用Microcal Origin 7.5（美國Microcal公司）軟件分析，采用0.05水平。

2 結(jié)果與討論

2.1 高靜壓參數(shù)對樹莓PPO活性的影響

圖1為高靜壓處理壓力對PPO活性的影響。如圖所示，在壓力影響下PPO的活性存在激活和鈍化兩種現(xiàn)象。在較短的持壓時間下，隨著壓力的升高，PPO活性表現(xiàn)為先激活后鈍化。在 100MPa和200MPa處理5min后，樹莓PPO的活性分別提高了5.180%和8.868%（P＜0.05）。相似的現(xiàn)象在高靜壓處理蘋果［14］、蘑菇［10］來源的PPO中也有報道。文獻報道，PPO具有激活和潛伏兩種存在形式［13］，并且有報道稱高靜壓可能使?jié)摲鼞B(tài)PPO轉(zhuǎn)化為激活態(tài)表現(xiàn)催化活性［14］。因此推測高靜壓處理對PPO活性的影響是一個動態(tài)的過程，一方面高靜壓使部分PPO失活；另一方面，潛在形式的PPO被高壓激活，呈現(xiàn)出來的酶活是兩者共同作用的結(jié)果。而在較長的持壓時間下，隨著壓力的升高，PPO活性逐漸降低，在100MPa和600MPa處理45min后，PPO相對活性分別降為87.428%和40.976%（P＜0.05）；與前人對草莓［3］、香蕉［4］、辣椒［5］、荔枝［6］、鱷梨［7］等來源的 PPO耐壓性相比，樹莓中的PPO保存了較高的相對活性，推測可能是由于樹莓PPO對壓力敏感性較弱，對壓力的耐受較強而不易鈍化。

圖1 壓力對樹莓PPO活性的影響

2.2 高靜壓鈍化樹莓PPO的一級動力學(xué)分析

圖2為樹莓PPO在持續(xù)的高壓和持壓時間下活性的變化規(guī)律。如圖所示，除了100、200MPa的較低壓力短時條件下樹莓PPO活性表現(xiàn)為激活外，樹莓PPO活性整體表現(xiàn)為被高壓鈍化。進一步應(yīng)用一級反應(yīng)動力學(xué)公式分析高靜壓鈍化樹莓PPO的過程，如圖2、表1所示。高靜壓處理后，所有壓力下PPO的相對酶活取對數(shù)與處理時間有良好的線性關(guān)系，R2≥0.900，表明高靜壓對PPO的鈍化符合一級動力學(xué)過程。從表1可以看出，隨著壓力升高，k值不斷增大，壓力從100MPa增加到600MPa，樹莓PPO的鈍化速率增加了近4倍，相應(yīng)的D值逐漸減小，從100MPa時的 492.094min縮短至 600MPa時的127.520min，即鈍化90%的酶活，600MPa較100MPa處理可以節(jié)約364.574min。表明壓力對PPO的鈍化有顯著影響，提高處理壓力能夠有效提高鈍化效率，縮短鈍酶時間。通過比較k值的變化率，研究還發(fā)現(xiàn)100～500MPa時的k值增大速率介于11%～25%之間，而600MPa的k值比500MPa時增大80%，說明600MPa條件下對酶的影響更為劇烈。Montero等［15］用高壓鈍化對蝦PPO也出現(xiàn)類似結(jié)果，該PPO活性經(jīng)200MPa處理10min后殘存酶活還有70%以上，但300MPa處理10min后殘存酶活僅為25%，此時酶活降幅比其他條件明顯劇烈。

圖2 高靜壓鈍化樹莓PPO的動力學(xué)

表1 高靜壓處理鈍化樹莓PPO的動力學(xué)參數(shù)

D值對壓力的敏感性用ZP來表示，ZP代表能導(dǎo)致D值變化一個對數(shù)值的壓力變化，以logD為y軸，壓力P為x軸，所得直線的斜率的倒數(shù)即為ZP值。如圖3所示，高靜壓鈍化樹莓 PPO的 ZP值為917.431MPa。利用Origin軟件分析可得到圖4，利用Eyring公式（公式6）計算可得高靜壓處理條件下樹莓PPO的活化體積Va為-6.020cm3/mol，相關(guān)系數(shù)R2=0.926。計算所得的Va為負(fù)值，說明隨著壓力的增加反應(yīng)速率常數(shù)也在增大。與其他文獻［7，11，16-17］中報道的數(shù)據(jù)相比，本實驗所得Va值較低，表明樹莓PPO高靜壓失活速率常數(shù)受壓力的影響較小，即樹莓PPO的耐壓性較強。

3 結(jié)論

100～600MPa下，持壓5～45min的高靜壓處理對樹莓PPO有鈍化效果，雖然低壓短時處理有部分激活現(xiàn)象，但隨著壓力升高和持壓時間的延長，樹莓PPO的活性逐漸降低，600MPa，45min處理后樹莓PPO殘存活性為40.976%。與其它來源的PPO相比，樹莓PPO的耐壓敏感性較低。高靜壓鈍化樹莓PPO的過程符合一級動力學(xué)模型，R2＞0.900。隨著壓力升高和持壓時間的延長，k值不斷升高，D值不斷減??；動力學(xué)參數(shù)Zp和Va分別為917.431MPa和-6.020cm3/mol。

圖3 高靜壓鈍化樹莓PPO的Zp值

圖4 高靜壓鈍化樹莓PPO的Va值

［1］Oey I，Lille M，Hendrickx M，et al.Effect of high-pressure processing on color，texture and flavour of fruit-and vegetablebased food products：a review［J］.Trends in Food Science and Technology，2008，19（6）：320-328.

［2］Oey I，Plancken I V，Hendrickx M，et al.Does high pressure processing influence nutritional aspects of plant based food systems？［J］.Trends in Food Science and Technology，2008，19（6）：300-308.

［3］Dalmadi I，Rapeanu G，Hendrickx M，et al.Characterization and inactivation by thermal and pressure processing of strawberry（fragaria ananassa）polyphenol oxidase［J］.Journal of Food Biochemistry，2006，30（1）：56-76.

［4］MacDonald L，Schaschke C J.Combined effect of high pressure，temperature and holding time on polyphenoloxidase and peroxidase activity in banana（Musa acuminata）［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80（6）：719-724.

［5］Castro S M，Saraiva J A，Lopes-da-Silva J A，et al.Effect of thermal blanching and of high pressure treatments on sweet green and red bell pepper fruits（Capsicum annuum L.）［J］.Food Chemistry，2008，107（4）：1436-1449.

［6］Phunchaisri C，Apichartsrangkoon A.Effects of ultra-high pressure on biochemical and physical modication of lychee（Litchi chinensis Sonn.）［J］.Food Chemistry，2005，93（1）：57-64.

［7］Weemaes C，Ludikhuyze L，Broeck I，et al.Kinetic Study of Antibrowning Agentsand Pressure Inactivation ofAvocado Polyphenoloxidase［J］.Journal of Food Science，1999，64（5）：823 -827.

［8］Sun N，Lee S，Song K B.Effect of High Pressure Treatment on the Molecular Properties of Mushroom Polyphenoloxidase［J］.LWT -Food Science and Technology，2002，35（4）：315-318.

［9］Gomes M R A，Ledward D A.Effect of high-pressure treatment on the activity of some polyphenoloxidases［J］.Food Chemistry，1996，56（1）：1-5.

［10］Rapeanu G，Loey A V，Hendrickx M，et al.Biochemical characterization and process stability of polyphenoloxidase extracted from Victoria grape（Vitis vinifera ssp.Sativa）［J］.Food Chemistry，2006，94（2）：253-261.

［11］Rapeanu G，Loey A V，Hendrickx M，et al.Thermal and High-Pressure Inactivation Kinetics of Polyphenol Oxidase in Victoria Grape Must［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53：2988-2994.

［12］Hendrickx M，Ludikhuyze L，van den Broeck I，et al.Effects of high pressure on enzymes related to food quality［J］.Trends in Food Science and Technology，1998，9（5）：197-203.

［13］Yoruk R，Marshall M R.Physicochemical properties and function of plant polyphenol oxidase：a review［J］.Journal of Food Biochemistry，2003，27（5）：361-422.

［14］Buckow R，Weiss U，Knorr D.Inactivation kinetics of apple polyphenol oxidase in different pressure-temperature domains［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，on line.

［15］Montero P，Avalos A，Perez-Mateos M.Characterization of polyphenoloxidase of prawns（Penaeus japonicus）.Alternatives to inhibition：additives and high-pressure treatment［J］.Food Chemistry，2001，75（3）：317-324.

［16］Rapeanu G，Loey A V，Smout C，et al.Effect of pH on Thermal and/or Pressure Inactivation of Victoria Grape（Vitis vinifera sativa）Polyphenol Oxidase：A Kinetic Study［J］.Journal of Food Science，2005，70：301-307.

［17］Weemaes C A，Ludikhuyze L R，Hendrickx M E.Kinetics of Combined Pressure-Temperature Inactivation ofAvocado Polyphenoloxidase［J］.Biotechnology and Bioengineering，1998，60（3）：292-300.

Kinetic study of high hydrostatic pressure processing on polyphenol oxidase from raspberry

JIANG Jun，ZHANG Yan*，LIAO Xiao-jun，HU Xiao-song，SUN Zhi-jian
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

High hydrostatic pressure technique（HHP）was used to inactivate the polyphenol oxidase（PPO）of raspberry for making raspberry products fresher and raising their added value.The inactivation kinetics of polyphenol oxidase（PPO）under HHP was investigated.The results showed that the activity of raspberry PPO gradually decreased with the pressure increasing and/or the holding time extending，in spite that the PPO was activated under low pressure for short holding time.Residual activity of PPO was 40.976%treated by 600MPa for 45 minutes.Further，the inactivation of PPO under HHP can be adequately described by the first-order model，and the effect of pressure on the inactivation of PPO can be analyzed with Eyring equation.With the pressure increasing，the PPO inactivation rate constants k increased and the decimal reduction time D reduced.The Zpand Vawere 917. 431MPa and-6.020cm3/mol respectively.

high hydrostatic pressure；raspberry；polyphenol oxidase；kinetic

TS255.1

A

1002-0306（2010）11-0127-04

2009-09-11 *通訊聯(lián)系人

江?。?982-），女，碩士，研究方向：食品非熱加工技術(shù)。

國家“863”計劃重點課題（2007AA100405）。