胡麗花，蘇東民，蘇東海，辛秀蘭

（1.河南工業(yè)大學(xué)，河南鄭州450052；2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029）

混合發(fā)酵生產(chǎn)饅頭菌種的篩選

胡麗花1，蘇東民1，蘇東海2，*，辛秀蘭2

（1.河南工業(yè)大學(xué)，河南鄭州450052；2.北京電子科技職業(yè)學(xué)院，北京100029）

傳統(tǒng)饅頭制作屬于自然雜菌混合發(fā)酵，傳統(tǒng)發(fā)酵使其具有獨(dú)特風(fēng)味。本研究主要是從傳統(tǒng)的饅頭發(fā)酵劑中篩選性能優(yōu)良，適于饅頭混合發(fā)酵的酵母菌和乳酸菌。通過對采集到的14個樣品中的微生物進(jìn)行分離、篩選、復(fù)篩，篩得性能較好的酵母菌和乳酸菌各15株，酵母菌中尤以Sq4-3、Sq7-2、Sq9-2、Sq9-4和JZ1-4的發(fā)酵性能最好。最后挑選酵母菌Sq4-3與5株代表性乳酸菌進(jìn)行饅頭混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明不同乳酸菌對饅頭品質(zhì)的影響不同，其中添加Sq2.2的酸面團(tuán)發(fā)酵的饅頭總體感官評分最高，為7.56分。

乳酸菌，酵母菌，篩選，饅頭

自從面包酵母被發(fā)明和使用以來，因其方便性而逐漸取代了傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑。傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑的使用雖然存在缺陷，但其混合菌種發(fā)酵使成品具有獨(dú)特風(fēng)味或特殊功能［1］。近年來國外對傳統(tǒng)發(fā)酵劑酸面團(tuán)的研究表明：酸面團(tuán)的微生物為酵母菌和乳酸菌，應(yīng)用酸面團(tuán)能夠改善面包的風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)，增加營養(yǎng)價值，延長貨架期等［2］。我國傳統(tǒng)主食發(fā)酵劑資源豐富，很有必要對我國傳統(tǒng)主食發(fā)酵劑進(jìn)行系統(tǒng)研究。本文的目的是根據(jù)菌種的形態(tài)特征、生化特性從采集到的傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵劑中分離、篩選出性能優(yōu)良且適于混合發(fā)酵饅頭的酵母菌和乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

樣品 河南省商丘和焦作的14個酵子樣品；小麥粉 北京大磨坊面粉有限公司；培養(yǎng)基 綜合馬鈴薯培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基。

LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；Model 9960A Ultrasonic cleaners CBL photoelectron TECHNOLOGY；超凈工作臺 北京昌平長城空氣凈化工程公司；HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；WJ-160A-Ⅱ二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；3K15高速離心機(jī) Sigma。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的采集 從河南省商丘市采集11個樣品標(biāo)號為Sq1～11；來自河南省焦作孟州得3個樣品編號為JZ1～3。將樣品裝入無菌瓶中，0～4℃保存。

1.2.2 微生物計(jì)數(shù) 各取樣品1g分別加入到99mL無菌水中，超聲波振蕩20min，用無菌移液管準(zhǔn)確吸取上清液1mL，加無菌水9mL進(jìn)行稀釋，10倍等梯度稀釋法至10-7，分別取10-4，10-5，10-6，10-7濃度梯度稀釋液各0.1mL，分別涂布于綜合馬鈴薯培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂和MRS培養(yǎng)基平板，每個梯度做2個平行，于28、28、30℃倒置培養(yǎng)72h，進(jìn)行計(jì)數(shù)［3］。

1.2.3 菌種分離和篩選

1.2.3.1 酵母菌的分離和篩選 酵母菌的分離與篩選用含0.5g/L氯霉素的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，從菌落特征明顯的單菌落上挑起少許移植于斜面培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)72h，進(jìn)行第1次純化。挑取純化后的菌落少許劃線接種于分離培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)72h，進(jìn)行第2次分離。按照第1次純化操作進(jìn)行第2次純化，鏡檢。將采用連續(xù)劃線分離純化的菌種用麥芽汁瓊脂斜面4℃保藏［3］。

1.2.3.2 乳酸菌的分離和篩選 每一樣品系列稀釋度的菌懸液接種于MRS瓊脂平板，由MRS瓊脂培養(yǎng)基的自動篩選進(jìn)行分離。MRS瓊脂培養(yǎng)基，添加還原劑（L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1%，W/V），滅過菌后傾注平板前加入無菌放線菌酮稀釋液（0.01%，W/V）抑制酵母菌的生長［4-5］，5%CO2，30℃，培養(yǎng)72h［6］。分離菌株根據(jù)以下篩選標(biāo)準(zhǔn)確定：形態(tài)觀察、革蘭氏反應(yīng)、過氧化氫酶反應(yīng)，同型或異型發(fā)酵，15～45℃的生長情況。桿菌或球菌、革蘭氏陽性（紫）、過氧化氫酶陰性（無氣泡）為乳酸菌［5］。

1.2.4 菌種的復(fù)篩

1.2.4.1 酵母菌的復(fù)篩 發(fā)酵性能：采用杜氏管發(fā)酵法，將分離純化后的酵母菌接種于麥芽汁培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，測定酵母菌株產(chǎn)氣泡的快慢、在規(guī)定時間內(nèi)產(chǎn)氣泡的多少及產(chǎn)生氣味的濃度和類型，初步比較各株酵母菌的起酵能力、發(fā)酵能力及產(chǎn)香能力，初篩出性能優(yōu)良的酵母菌［3］。菌株特性：進(jìn)行耐酸能力實(shí)驗(yàn)，將酵母接入麥芽汁培養(yǎng)基中，將麥芽汁培養(yǎng)基的pH用1mol/L的H2SO4調(diào)pH分別為3.2、4.2、5.2和6.2；滅菌后，按2%接種量接入活化好的酵母菌，28℃培養(yǎng)10h，于波長660nm處測OD值，確定其耐酸能力［3］。

1.2.4.2 乳酸菌的復(fù)篩 乳酸菌產(chǎn)酸、產(chǎn)味實(shí)驗(yàn)：向含有5%面粉的無菌溶液中接入1%過夜培養(yǎng)的乳酸菌培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)24h，用pH計(jì)測酸度［5］，同時檢查其產(chǎn)味情況。

1.2.5 混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 菌種和老面團(tuán)制備 取新鮮培養(yǎng)酵母菌種和乳酸菌的斜面菌種一環(huán)，分別接種到裝有20mL無菌麥芽汁和MRS液體培養(yǎng)基，28℃和30℃培養(yǎng)24h。然后接種到裝有100mL上述培養(yǎng)基的三角瓶，同上培養(yǎng)24h后，于4℃、5000×g離心15min，除去上清液，獲得微生物的細(xì)胞溶于無菌生理鹽水，用于饅頭實(shí)驗(yàn)。

2000mL大燒杯中600g水，400g面粉混合，LAB和/或酵母的接種量為 105～106cfu/g，24℃，發(fā)酵12h［7］。

1.2.5.2 發(fā)酵饅頭及評價 采用軟式主食饅頭發(fā)酵方法：按面團(tuán)的20%添加酸面團(tuán)，同時添加面包酵母0.5%［7-8］。50g酸面團(tuán)，20mL水，0.5g燕子牌即發(fā)干酵母，70g饅頭專用粉，用手混勻后，形成光滑完整的面團(tuán)。將面團(tuán)置于溫度為32±2℃、相對濕度為85%的醒發(fā)箱中發(fā)酵40min。取出添加10g面粉揉成半圓型面團(tuán)，同以上發(fā)酵條件醒發(fā)20min。采用Φ33cm的不銹鋼鍋，加入1800mL水，加熱至沸騰后將饅頭坯放在蒸箅上，蓋嚴(yán)，沸水汽蒸20min，停火2min后，取出饅頭。20min后對其體積、外表狀況、內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)、香味、口感進(jìn)行感官評價［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物計(jì)數(shù)

由于地理位置及存儲時間的不同，不同樣品的活菌數(shù)不同，酵母菌的活菌數(shù)106～109cfu/g不等，乳酸菌的活菌數(shù)為105～108cfu/g。

2.2 酵母菌和乳酸菌的初步分離和篩選結(jié)果

主要根據(jù)菌株的外形特征及生化特性對14個樣品中的微生物進(jìn)行初步分離和篩選，分別挑選出菌落特征明顯且生長良好的酵母菌和乳酸菌單菌落分別為56個和67個。一般形態(tài)特征為細(xì)胞呈球形、卵圓形或橢圓形，單細(xì)胞，有核，無鞭毛；菌落呈圓形或橢圓形，凸起，表面光滑濕潤的為酵母菌。桿菌或球菌、革蘭氏陽性（紫）、過氧化氫酶陰性（無氣泡）的為乳酸菌。酵母菌和乳酸菌分別進(jìn)行美蘭染色，革蘭氏染色后進(jìn)行顯微鏡觀察的照片如圖1、圖2所示。

圖1 酵母菌

圖2 乳酸菌

傳統(tǒng)主食發(fā)酵劑屬于自然雜菌混合發(fā)酵，其主要優(yōu)勢菌群為酵母菌和乳酸菌，酵母菌起發(fā)酵面團(tuán)作用，乳酸菌酸化面團(tuán)從而影響面團(tuán)及終產(chǎn)品的特性。丁長河等［4］曾對傳統(tǒng)起子-酵頭中的微生物進(jìn)行分析，根據(jù)碳水化合物的發(fā)酵和吸收從12個傳統(tǒng)酵頭樣品中分離出4種細(xì)菌和3種酵母菌，經(jīng)生物梅里埃的Vitek-32系統(tǒng)自動鑒定，分離得到的3株酵母菌都為釀酒酵母，3株細(xì)菌分別為蠟樣芽孢桿菌、魯氏不動桿菌和短小芽孢桿菌。Hulya Gul等［5］從面包酸面團(tuán)中篩選的酵母菌為Saccharomyces cerevisiae，S.delbrueckii，Torulopsis holmii and T.unisporus；乳酸菌有Lactobacillus divergens，Lactobacillus brevis，Lactobacillus amylophilus，Lactobacillus sake， Lactobacillus acetotolerans，Lactobacillus plantarum， Pediococcus pentosaceus，P.acidilactici和Tetragenococcus halophilus。

2.3 復(fù)篩

本研究的目的是從傳統(tǒng)的饅頭發(fā)酵劑中篩選性能優(yōu)良的酵母菌和乳酸菌，并且適于純菌接種混合發(fā)酵生產(chǎn)具有特殊風(fēng)味或特定功能饅頭的菌種。在面團(tuán)發(fā)酵過程中酵母菌起發(fā)酵面團(tuán)的作用，在混合發(fā)酵過程中，乳酸菌會產(chǎn)酸使面團(tuán)的pH降低。所以對酵母菌主要根據(jù)其發(fā)酵性能、耐酸能力來進(jìn)行復(fù)篩，經(jīng)復(fù)篩挑選出15株，其編號及篩選結(jié)果如表1，尤其Sq4-3、Sq7-2、Sq9-2、Sq9-4、JZ1-4的性能較好。

表1 酵母菌的分離與篩選

表2 乳酸菌的分離與篩選

表3 菌種組合及評價結(jié)果

酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵過程中，若乳酸菌產(chǎn)酸能力太強(qiáng)，pH太低不僅會抑制酵母菌的生長，進(jìn)而影響面團(tuán)發(fā)酵性能，而且酸味過重影響產(chǎn)品風(fēng)味，導(dǎo)致終產(chǎn)品不被消費(fèi)者所接受。同時考慮到乳酸菌起影響風(fēng)味的作用，所以乳酸菌復(fù)篩過程中主要根據(jù)其產(chǎn)酸產(chǎn)味特性篩出15株，其編號及篩選結(jié)果如表2。

2.4 混合發(fā)酵

篩選性能優(yōu)良的酵母菌和乳酸菌是首要任務(wù)，但純菌接種混合發(fā)酵是今后研究的方向和重點(diǎn)。基于這一要求，挑選出一株優(yōu)良的酵母菌和5株產(chǎn)酸能力不同的代表性乳酸菌進(jìn)行饅頭混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，菌種組合及評價結(jié)果見表3。

由表3可以看出，添加乳酸菌的酸面團(tuán)發(fā)酵的饅頭其感官總體評分要比只添加酵母菌的要高，而不同乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵對饅頭品質(zhì)的影響也不同，添加乳酸菌Sq2.2的酸面團(tuán)發(fā)酵的饅頭其總體感官評分最高為 7.56分，其次為 Sq3.1、Sq6.3和Sq4.5。

3 結(jié)論

根據(jù)菌株的外形特征及生化特性進(jìn)行初步分離和篩選，再結(jié)合面團(tuán)發(fā)酵過程中酵母菌和乳酸菌各自起的作用確定復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過復(fù)篩，其中酵母菌中Sq4-3、Sq7-2、Sq9-2、Sq9-4和JZ1-4的發(fā)酵性能較好。最后挑選酵母菌Sq4-3與5株代表性乳酸菌進(jìn)行混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵對饅頭品質(zhì)的影響也不同，其中添加乳酸菌Sq2.2的酸面團(tuán)發(fā)酵的饅頭總體感官評分最高為7.56分，其次為Sq3.1、Sq6.3和Sq4.5。

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Screening strains for co-fermenting Mantou

HU Li-hua1，SU Dong-min1，SU Dong-hai2，*，XIN Xiu-lan2
（1.College of Grain and Food，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China；2.Biology Department，Beijing Vocational College of Electronic Science，Beijing 100029，China）

Traditional Mantou was fermented by natural mixed starter cultures with unique flavor.ln this study，the purpose is to screen lactic acid bacterias and yeasts from traditional starter cultures of Mantou，which have fine performance and are appropriate to co-ferment Mantou.The microorganisms of 15 LABs and 15 yeasts were obained from 14 samples through separating，screening and re-screening，especially the best strains were Sq4-3，Sq7-2，Sq9-2，Sq9-4 and JZ1-4 among yeasts.Eventually Sq4-3 and 5 representative strains among lactic acid bacterias were chosen to co-ferment Mantou.The results showed that different LAB had different effect on quality of Mantou.Mantou fermented by sourdough adding Sq2.2 have the highest score for the overall sense 7.56 points.

lactic acid bacteria；yeast；screen；Mantou

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-203-04

2009-08-28 *通訊聯(lián)系人

胡麗花（1983-），女，碩士研究生，研究方向：傳統(tǒng)食品的工業(yè)化。

北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（5093026）；北京市教委科技計(jì)劃面上項(xiàng)目（KM200900002003）。