許靖逸，邵宛芳，*，張 俊，王文光，袁 唯

（1.云南農(nóng)業(yè)大學龍潤普洱茶學院，云南昆明650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院，云南昆明650000；3.云南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，云南昆明650201）

普洱茶(熟茶)中主要霉菌的分離與鑒定

許靖逸1，邵宛芳1，*，張 俊2，王文光3，袁 唯3

（1.云南農(nóng)業(yè)大學龍潤普洱茶學院，云南昆明650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院，云南昆明650000；3.云南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，云南昆明650201）

“渥堆”過程和貯藏工藝是普洱茶具有獨特品質(zhì)的主要原因，而“渥堆”過程中微生物發(fā)揮了重要作用。本實驗對云南省普洱茶主產(chǎn)區(qū)的普洱熟茶中的主要霉菌進行分離鑒定，旨在探討普洱熟茶中主要的霉菌種類。

普洱茶，霉菌，分離，鑒定

根據(jù)GB/T 22111規(guī)定，普洱茶是指以地理標志保護范圍內(nèi)的云南大葉種曬青茶為原料，并在地理標志保護范圍內(nèi)采用特定的加工工藝制成，具有獨特品質(zhì)特征的茶葉。按其加工工藝及品質(zhì)特征，普洱茶分為普洱茶（生茶）和普洱茶（熟茶）兩種類型。在普洱茶（熟茶）的加工過程中，要以云南大葉種制成的曬青毛茶作為原料，經(jīng)過潮水、后發(fā)酵、陳化及干燥工序。普洱茶品質(zhì)形成是原料、加工工藝、加工環(huán)境條件等綜合作用的結(jié)果，其中渥堆是一道最為關鍵的工序，根據(jù)陳宗道［1］研究發(fā)現(xiàn)，普洱茶渥堆過程中存在黑曲霉、青霉、根霉、灰綠曲霉、酵母等微生物，黑曲霉約占微生物總數(shù)的80%左右。胡建程［2-3］等先后在各種再加工茶中分離鑒定出青霉（Penicllium）、曲霉（Aspergillius）、毛霉（Mucor）、根霉（Rhizopus）、蠟中枝孢霉（Cladosprium）等。研究發(fā)現(xiàn)即使在普洱成品茶中這些微生物還存在，對普洱茶品質(zhì)的形成始終都起到了相當重要的作用。本研究以云南普洱茶主產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)的普洱熟茶為材料，對其中的霉菌進行分離鑒定，旨在探討普洱熟茶中主要的霉菌種類，為消費者放心飲用普洱茶提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

以云南普洱茶主產(chǎn)區(qū)中主要廠家生產(chǎn)的普洱熟茶（散茶和餅茶）為供試材料 所選樣品均具有普洱茶（熟茶）正常的品質(zhì)特征。具體情況見表1；培養(yǎng)基分離曲霉類（PDA培養(yǎng)基）、黑曲霉屬純化培養(yǎng)基。

表1 供試材料表

SW-CJ-IA型超凈工作臺，BII.500-S型電熱恒溫培養(yǎng)箱，S.C.101-1型鼓風電熱干燥箱，A13204-N型電子分析天平，JLQ-SI型菌落計數(shù)器，HZQ-QX型全溫振蕩器，OLYMPUS型顯微鏡，Motic-AE31型顯微攝影用倒置顯微鏡，高壓濕熱蒸汽滅菌鍋，粉碎機組織搗碎機，顯微鏡SONY數(shù)碼照相機，細菌生化微量鑒定管，冰箱，微波爐等。

1.2 實驗方法

霉菌的分離與計數(shù)選用孟加拉紅培養(yǎng)基；樣品稀釋液的制備［4］；接種［5］；選菌及純化［6］；載片培養(yǎng)；顯微觀察及顯微攝影；霉菌的鑒定主要通過菌落特征、顯微形態(tài)觀察和顯微測微尺法進行測量鑒定，結(jié)合《真菌鑒定手冊》［6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱茶樣中霉菌及其優(yōu)勢菌的數(shù)量差異

普洱茶后發(fā)酵過程中，霉菌對其品質(zhì)的形成起到很大作用。普洱茶產(chǎn)品特別是壓制茶，經(jīng)過篩分和高溫蒸壓后，殘留在其中的霉菌數(shù)量很少。本實驗采用25℃無菌水進行處理，用孟加拉紅培養(yǎng)基對普洱茶產(chǎn)品中殘留的霉菌及其優(yōu)勢菌進行分離計數(shù)，其結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 25℃水溫處理普洱餅茶中霉菌數(shù)量

圖1和圖2表示經(jīng)室溫水處理的餅茶散茶中霉菌及其優(yōu)勢霉菌的數(shù)量差異，由圖1和圖2可知，普洱茶中霉菌數(shù)量較少，僅達102個/g，餅茶中霉菌的數(shù)量極少，且以6號茶和7號茶即思茅地區(qū)生產(chǎn)的普洱茶中霉菌的數(shù)量居多；散茶中的霉菌可達104個/g，其數(shù)量是餅茶中的100倍左右，可能是由于加工工藝或生產(chǎn)環(huán)境的不同造成普洱茶中微生物數(shù)量的差異。散茶中，尤其是9號茶中霉菌的數(shù)量較少。

2.2 普洱茶樣中霉菌的鑒定

在16份普洱茶樣品中，共分離純化得到5株霉菌類菌株，經(jīng)形態(tài)及培養(yǎng)特征、生理生化反應觀察，依據(jù)《真菌鑒定手冊》［6］、《中國真菌志》［7］，并經(jīng)真菌學專家劉云龍驗證，鑒定結(jié)果如下：

2.2.1 青霉屬（Penicillium） 按照《真菌鑒定手冊》［6］和《中國真菌志》［7］的方法對該菌進行初步鑒定，結(jié)果如圖3～圖5所示。

菌落形態(tài)：生長速度一般，絨狀，菌落近似圓形，初為白色，隨著不斷的生長逐漸變成淺藍色，后變?yōu)樗{綠色至灰綠色，邊緣為白色環(huán)狀，有淺黃色液滴，背面變?yōu)闊o色至淺黃色，有皺褶。

圖3 單菌落

圖5 分生孢子（×600）

個體形態(tài)：帚狀枝有分枝1～2次，不對稱，小梗不作批針狀，不分散，分枝緊湊，分枝與間枝近似于平行排列，孢子鏈分開，小梗頂端驟然變細削，分生孢子有球形、圓柱形、橢圓形等多種形態(tài)。

該菌的分類地位為真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi Imperfect），從梗孢目（Moniliales），從梗孢科（Moniliaceae），從梗孢科單孢亞科（Amerosporoideae of Monilliaceae），曲 霉 族（ Aspergilleae），青 霉 屬（Penicillium LK.ex Fries）［8］。該種青霉能產(chǎn)生檸檬酸霉素［9-11］，對普洱茶醇和品質(zhì)的形成具有一定的作用［12］。

2.2.2 曲霉屬（Aspergillus）

2.2.2.1 Aspergillus 01 按照《真菌鑒定手冊》［6］和《中國真菌志》［7］的方法對Aspergillus 01進行初步鑒定，結(jié)果如圖6～圖8所示。

圖6 單菌落

圖7 產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（×600）

圖8 分生孢子（×600）

菌落形態(tài)：該菌在PDA培養(yǎng)基上生長旺盛，菌落初生為乳白色，后中心變?yōu)闇\藍色，最后變成青綠色，似青霉。菌落表面呈絨毛狀，邊緣為白色，背面變?yōu)闇\黃色。在28～30℃下培養(yǎng)3～4d，直徑可長到3.0～4.0cm左右大小。

個體形態(tài)：分生孢子梗頂端膨大呈燒瓶形或近圓形的囊狀，其梗徑5～8μm，其上著生有雙層小梗，孢子穗為圓球形，直徑100～150μm，分生孢子為球形，直徑2.5～3.5μm。

該霉菌的分類地位為真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi Imperfect），叢梗孢目（Moniliales），從梗孢科（Moniliaceae），從梗孢科單胞亞科（Amerosporoideae of Monilliaceae），曲 霉 族（ Aspergilleae），曲 霉 屬（Aspergillus Micheli ex Fr），薩氏曲霉組（A.sydowi）。該菌對普洱茶呈香起重要作用。

2.2.2.2 Aspergillus02 按照《真菌鑒定手冊》［6］和《中國真菌志》［7］的方法對該菌進行初步鑒定，結(jié)果如圖9～圖13所示。

圖9 產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（×600）

菌落形態(tài)：菌落在PDA培養(yǎng)基上生長迅速，在28～30℃下培養(yǎng)7d，菌落鋪滿整個平板；菌落平坦或中心稍凸起，有規(guī)則或不規(guī)則的輻射狀溝紋，質(zhì)地絲絨狀或稍呈絮狀，有的偶有過度生長，表面呈暗褐色至炭黑色，滲出液有或無，具或不具霉味；在平面培養(yǎng)基上生于中央，在斜面培養(yǎng)基上生于基部，菌落反面無色、黃色、黃褐色或帶微黃色。

個體形態(tài)：分生孢子結(jié)構(gòu)大，呈黑褐色至炭褐色，分生孢子頭初為球形至輻射狀，直徑 150～470mm，老后分裂成幾個圓柱形，可達780mm左右，有的菌株產(chǎn)生菌核。孢梗莖1500μm×9～20μm，壁光滑，老時帶黃色或黃褐色；頂囊球形或近球形，老時暗褐色。

圖10 分生孢子梗（×150）

圖11 分生孢子（×600）

圖12 俯視分生孢子頭（×150）

圖13 單菌落

該霉菌的分類地位為真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi Imperfect），叢梗孢目（Moniliales），從梗孢科（Moniliaceae），從梗孢科單胞亞科（Amerosporoideae of Monilliaceae），曲 霉 族（ Aspergilleae），曲 霉 屬（Aspergillus Micheli ex Fr），黑曲霉組（A.niger）［8］。

該菌是一種食品工業(yè)生產(chǎn)中的安全性菌群，是參與普洱茶品質(zhì)形成的主要菌種，在生產(chǎn)中具有重要經(jīng)濟意義［13］。黑曲霉能產(chǎn)生20種左右的水解酶，其中糖苷酶、果酸酶、葡萄糖淀粉酶、纖維素酶、柚苷酶、乳酸酶、葡萄糖氧化酶等許多酶類，還可以分解包括多糖、脂肪、蛋白質(zhì)、果膠、天然纖維和不可溶性化合物等有機物；并且它的異變菌可產(chǎn)生草酸、檸檬酸、葡萄糖酸、抗壞血酸等。在普洱茶渥堆發(fā)酵陳化中，黑曲霉代謝產(chǎn)生的有機酸和酶等對普洱茶品質(zhì)的形成起著重要的作用。

其產(chǎn)生的葡萄糖淀粉酶、纖維素酶和果膠酶等可以分解包括多糖、脂肪、蛋白質(zhì)、天然纖維、果膠和不可溶性水化合物等有機物，水解的產(chǎn)物大多為單糖、氨基酸、水化果膠和可溶性碳水化合物，使茶葉內(nèi)所含有效成分易于滲出、擴散，為增強茶湯的滋味和形成普洱茶甘滑、醇厚的品質(zhì)特色奠定了堅實的物質(zhì)基礎。所以說，在普洱茶發(fā)酵渥堆過程中黑曲霉代謝產(chǎn)生的有機酸和酶對普洱茶品質(zhì)的形成有著重要作用。

2.2.2.3 Aspergillus03 從成品普洱茶中分離出的菌體顯微照相見圖14～圖17所示。

圖14 幼時菌落

圖15 成熟菌落

圖16 產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)（×600）

圖17 分生孢子（×600）

菌落形態(tài)：菌落初呈黃色或淡黃綠色，后變黃褐色；在PDA培養(yǎng)基上生長速度一般，質(zhì)地粉粒狀或絨狀；培養(yǎng)基背面無色至淡黃色，無滲出液，有或無霉味。

個體形態(tài)：分生孢子圓形或洋梨形，直徑4～10μm，粗糙；分生孢子梗長達 2mm，直徑20～25μm，壁薄粗糙；頂囊直徑50～70μm，小梗單層或雙層。

該霉菌屬于真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi Imperfect），叢 梗 孢 目（Moniliales），從 梗 孢 科（Moniliaceae），從梗孢科單胞亞科（Amerosporoideae of Monilliaceae），曲 霉 族（ Aspergilleae），曲 霉 屬（Aspergillus Micheli ex Fr），黃-米曲霉組（A.flavusoryze）［14］。

本種在工業(yè)上用途很廣，主要是釀造酒精、味精和醬油；也可用于生產(chǎn)α-乳酸和糊化淀粉，對普洱茶回甘及陳香風味有一定影響。

2.2.3 毛霉目（Mucoraceae） 從成品普洱茶中共分離到2株毛霉目霉菌菌株，其鑒定結(jié)果如下：

2.2.3.1 根霉（Rhizopus） 按照《真菌鑒定手冊》［6］和《中國真菌志》［7］的方法進行初步鑒定，結(jié)果如圖18～圖20所示。

圖18 黑根霉菌叢

圖19 黑根霉形態(tài)（×150）

圖20 黑根霉假根（×600）

菌落形態(tài)：該菌在PDA培養(yǎng)基上生長時，初呈白色，絨毛狀，匍匐菌絲彎曲狀，在與培養(yǎng)基表面相接觸處產(chǎn)生假根，假根發(fā)達，分枝多，兩接間距離大約為1～2μm。

個體形態(tài)：孢梗直立不分枝，孢子囊球形或橢圓形，褐色或黑色，囊軸球形、橢圓形，直徑約為55μm，高約70μm。

經(jīng)鑒定，該菌屬于接合菌亞門（Zygomycotina）；接合菌綱（Zygomycetes）；毛霉目（Mucorales）；毛霉科（Mucoraceae），根霉屬（Rhizopus Ehrenberg），黑根霉（Rhizopus nigricans）。

除了細菌以外，黑根霉是迄今為止絲狀菌中產(chǎn)L-乳酸的另一重要菌種［15-16］，黑根霉淀粉酶的活力很高，能產(chǎn)生有機酸，如反丁烯二酸、乳酸、琥珀酸等，還能產(chǎn)生芳香的酯類物質(zhì)，也是轉(zhuǎn)化甾醇族化合物的重要菌類，在普洱茶加工儲放過程中生成一定數(shù)量的根霉，有利于普洱茶甜醇品質(zhì)的形成。

2.2.3.2 毛霉（Mucor） 按照《真菌鑒定手冊》［6］和《中國真菌志》［7］的方法對該菌進行初步鑒定，結(jié)果如圖21～圖23所示。

圖21 毛霉菌叢

圖22 毛霉孢子囊的著生（×600）

圖23 毛霉形態(tài)（×600）

菌落形態(tài)：通常菌絲體發(fā)達，分枝成蛛網(wǎng)狀，多核、無隔，氣生菌絲體往往生長繁茂，呈毛狀，毛霉的菌絲體在基質(zhì)上或基質(zhì)內(nèi)能廣泛蔓延，無假根和匍匐枝，生長速度很快，28～30℃下2d，菌落可以擴展整個平板。

個體形態(tài)：孢囊梗直接由菌絲體生出，一般單生，分枝較少或不分枝。分枝頂端都有膨大的孢子囊，囊軸與孢囊梗相連處無囊托。孢囊孢子成熟后，孢子囊壁破裂，孢囊孢子分散開來。毛霉菌絲初期為白色，后為灰白色至黑色，這說明孢子囊大量成熟。

該菌的分類地位為接合菌亞門（Zygomycotina）；接合菌綱（Zygomycetes）；毛霉目（Mucorales）；毛霉科（Mucoraceae）；毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）；總狀枝毛霉組（Racemosus）［17］。該菌分布很廣，是制造豆鼓的發(fā)酵菌之一，也是普洱茶發(fā)酵菌株之一。

3 結(jié)論

3.1 普洱茶中微生物含量很少，尤其是霉菌含量較少，僅達102個/g，餅茶中霉菌的數(shù)量更少。

3.2 本實驗從普洱茶樣中分離到3株曲霉，其中一株是黑曲霉、青霉、根霉和毛霉各1株，這些均為食品發(fā)酵工業(yè)常用的菌種。

綜上所述，普洱茶中所存在霉菌主要是一些青霉、曲霉等有益菌群，沒有發(fā)現(xiàn)對人體產(chǎn)生危害作用的微生物，本研究結(jié)果將對消費者放心飲用普洱茶提供理論依據(jù)。

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Isolation and identification of the main fungus from pu-erh tea

XU Jing-yi1，SHAO Wan-fang1，*，ZHANG Jun2，WANG Wen-guang3，YUAN Wei3
（1.College of Long Run Pu-erh Tea，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2.Yunnan Academy of Agricultural Science，Kunming 650000，China；3.College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）

The main reasons of forming unique quality are pile-fermentation process and storage technology in puerh tea.Moreover，microbes play a very important role during the pile-fermentation.The isolation and identification of fungus from pu-erh tea which had been picked from main pu-erh tea producing areas in Yunnan province were carried out to confer which fungus were in pu-erh tea.

pu-erh tea；fungus；isolation；identification

TS272.5+9

A

1002-0306（2010）12-0110-05

2009-02-04 *通訊聯(lián)系人

許靖逸（1980-），女，博士，主要從事茶葉生物技術與資源利用研究。

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項（nyhyzx3-35-14）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（茶葉）產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助。