李雪玲，郭 麗

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036）

柑桔萜油抑菌活性的研究

李雪玲，郭 麗

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036）

采用濾紙片法測(cè)定了柑桔萜油對(duì)食品中常見的幾種腐敗致病菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，并研究了pH和高溫處理對(duì)柑桔萜油抑菌活性的影響。結(jié)果表明，柑桔萜油具有廣譜的抗菌范圍，尤其對(duì)霉菌抑制作用更為顯著。柑桔萜油抑菌活性的pH作用范圍為5～9，并且熱穩(wěn)定性強(qiáng)。

柑桔萜油，抑菌活性

柑桔是蕓香科柑桔亞科的一種植物，共有六個(gè)屬［1］。我國(guó)民間就有用柑桔皮燒煙驅(qū)趕蚊蠅的作法，國(guó)內(nèi)外已證實(shí)這主要是由柑桔皮中的柑桔油在起作用［2］，這說明柑桔油具有很好的殺菌作用。而有關(guān)這方面的研究未見報(bào)道。近年研究表明，柑桔油生物活性的有效成分是其中的萜油（主要是d-檸檬烯），萜油是柑桔精油脫萜生產(chǎn)中大量廢棄的副產(chǎn)物［3］。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)柑桔萜油的抑菌作用進(jìn)行了初步的研究，希望能夠充分利用這些廢棄的萜油開發(fā)出一種天然防腐劑，為柑桔的綜合利用開辟一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮柑桔皮；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、黑曲霉（Aspergillum niger）、青霉（Penicillium sp）、根霉（Rhizopus sp）、毛霉（Mucor）、假絲酵母（Saccharomyces cerevisiae）、澳大利亞酵母（Saccharomyces australia）、葡萄酒酵母（S.ellipoideus）由本院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（細(xì)菌用） 牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL，pH7.2～7.4；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（霉菌用） 馬鈴薯300.0g、葡萄糖20.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL，pH自然；麥芽汁培養(yǎng)基（酵母用） 葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、酵母膏10.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL，pH自然；95%乙醇，石油醚，丙三醇，NaOH，HCl，Ca2CO3，Na2SO4，金屬鈉，含鋅粉的乙醇液，溴水等。

YXQ-SG41-280型高壓蒸汽滅菌鍋，PYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，HH-S11-2型電熱恒溫水浴鍋，BS200S型電子分析天平，HS-1300-U型無(wú)菌操作臺(tái)，721分光光度計(jì)，pHS-3C型數(shù)字式酸度計(jì)，冰箱等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 柑桔萜油的制備

1.2.2 供試菌株的制備［4］在無(wú)菌室中將供試菌種接入相對(duì)應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上。細(xì)菌置35～37℃培養(yǎng)18～24h，霉菌在28℃，培養(yǎng)48h；酵母菌置30℃，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)完之后放置0～4℃冷藏備用。

1.2.3 培養(yǎng)基平板制備［4］將配制好的各種菌種培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌后，冷卻至50～60℃，在無(wú)菌操作條件下將培養(yǎng)基傾注于高壓滅菌后的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15～20mL，放平至培養(yǎng)基凝固。

1.2.4 菌懸液制備［4］取活化培養(yǎng)好的菌株，用接種環(huán)分別挑取少量細(xì)菌、霉菌孢子和酵母菌體，各放入9mL無(wú)菌生理鹽水中，搖勻，制成孢子、菌體懸浮液，使菌懸液中細(xì)菌數(shù)為1～2×108個(gè)/mL、霉菌孢子數(shù)為1～8×106個(gè)/mL、酵母菌數(shù)為1～7×106個(gè)/mL。

1.2.5 濾紙片法［5］取直徑8mm的滅菌濾紙片放入柑桔萜油原液中浸泡24h。將各種待試菌懸液各取0.5mL與相應(yīng)固體培養(yǎng)基制成含菌平板，用無(wú)菌鑷子取含有柑桔萜油的濾紙片貼在固體平板上，每菌做3次重復(fù)。細(xì)菌置35～37℃培養(yǎng)18～24h，霉菌在28℃，培養(yǎng)48h，酵母菌置30℃，培養(yǎng)24h后觀察，選取抑菌圈比較明顯的平板測(cè)定抑菌圈直徑，結(jié)果取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.2.6 柑桔萜油最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 采用平板擴(kuò)散法［6］，分別將柑桔萜油原液用丙三醇倍比稀釋，加入培養(yǎng)基中，用平板劃線法接種，細(xì)菌置35～37℃培養(yǎng)18～24h，霉菌在28℃，培養(yǎng)48h；酵母菌置30℃，培養(yǎng)24h，以無(wú)菌水、空白提取液及提取物稀釋劑丙三醇作對(duì)照，以完全沒有菌生長(zhǎng)的最低提取物濃度為最低抑菌濃度（MIC）。

1.2.7 不同外界條件對(duì)柑桔萜油抑菌活性的影響

1.2.7.1 pH對(duì)柑桔萜油抑菌活性的影響［7］分別用蒸餾水和柑桔萜油配制霉菌培養(yǎng)基，分裝試管，以2mol/L的NaOH和HCl分別配成2份pH3～9的系列培養(yǎng)基，用蒸餾水配制的稱為S1、S2，用柑桔萜油配制的稱為S3、S4。四份培養(yǎng)基均不滅菌，S1、S3放入冰箱冷藏，S2、S4放入28℃恒溫箱培養(yǎng)。以S1、S3作為對(duì)照（吸光度A=0），在分光光度計(jì)上分別測(cè)定相應(yīng)pH下的吸光度A值。

1.2.7.2 高溫處理對(duì)柑桔萜油抑菌作用的影響［8］用柑桔萜油提取物代替蒸餾水配制成固體培養(yǎng)基，并在121℃條件下進(jìn)行濕熱滅菌，然后接種四種常見霉菌，28℃條件下培養(yǎng)2d以上，觀察生長(zhǎng)情況，以用蒸餾水配制的相應(yīng)培養(yǎng)基作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑桔萜油的抑菌效果

柑桔萜油對(duì)供試菌抑菌效果見表1所示?？咕匾志?shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)是：抑菌圈直徑＞15mm為最敏感、10～15mm為中度敏感，7～9mm為低度敏感，無(wú)抑菌者為不敏感［8］。

從表1可以看出，柑桔萜油對(duì)各種供試菌都有一定的抑菌作用。但相比較而言，柑桔萜油對(duì)霉菌和酵母菌的抑制作用要明顯大于對(duì)細(xì)菌的抑制作用，尤其是對(duì)根霉、毛霉和青霉的抑菌圈達(dá)到14.5mm，抑制作用最強(qiáng)；對(duì)葡萄酒酵母、澳大利亞酵母、黑曲霉抑菌圈也達(dá)到14.0mm，抑菌效果明顯；而對(duì)細(xì)菌也有一定的抑制作用，但效果不太明顯。

表1 柑桔萜油對(duì)供試菌的抑菌圈直徑

2.2 柑桔萜油最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果

表2 柑桔萜油提取液濃度對(duì)供試菌抑菌效力的影響

見表2。表2表明，柑桔萜油對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC為100mg/mL，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為50mg/mL，對(duì)假絲酵母的MIC為3.125mg/mL，對(duì)澳大利亞酵母和葡萄酒酵母的MIC為1.563mg/mL，對(duì)根霉、黑曲霉、毛霉和青霉的MIC為0.782mg/mL。

2.3 pH對(duì)柑桔萜油抑菌活性的影響

濾紙片法的測(cè)定結(jié)果表明，柑桔萜油對(duì)霉菌的抑菌效果更為明顯，所以本實(shí)驗(yàn)選用毛霉為對(duì)象菌，研究pH對(duì)柑桔萜油抑菌活性的影響。表3列出了毛霉培養(yǎng)1周后S2、S4 pH系列培養(yǎng)物的吸光度A值，其空白對(duì)照分別為S1、S3。

表3 不同pH培養(yǎng)物的吸光度值

由表3可以看出，用柑桔萜油配制的霉菌培養(yǎng)基S4中雜菌生長(zhǎng)濃度（渾濁度）明顯低于用蒸餾水配制的霉菌培養(yǎng)基S2，這表明柑桔萜油在pH5～9均有一定抑菌活性，并且柑桔萜油在酸性條件下抑菌活性明顯強(qiáng)于中性。

2.4 高溫處理對(duì)柑桔萜油抑菌作用的影響

本實(shí)驗(yàn)選用霉菌為對(duì)象菌，研究高溫處理對(duì)柑桔萜油抑菌作用的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 霉菌在經(jīng)121℃處理的蒸餾水、未高溫滅菌和高溫滅菌柑桔萜油馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

表4可以看出，蒸餾水培養(yǎng)基中的霉菌生長(zhǎng)情況都很好，而在高溫滅菌柑桔萜油培養(yǎng)基中毛霉、青霉和根霉全無(wú)生長(zhǎng)，黑曲霉有少量菌體生長(zhǎng)。說明柑桔萜油經(jīng)過121℃的高溫處理，其抑菌效果并未受到太大影響，這表明柑桔萜油具有良好的熱穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

柑桔萜油對(duì)大多數(shù)真菌類均有良好的抑菌作用，尤其是對(duì)霉菌極為顯著，而且所需的MIC較低，pH作用范圍廣、熱穩(wěn)定性強(qiáng)。相比較而言，柑桔萜油對(duì)細(xì)菌則無(wú)明顯的抑制作用。

在食品加工中，熱處理工藝非常普遍，本研究結(jié)果顯示柑桔萜油具有很好的熱穩(wěn)定性，這就給柑桔萜油在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了基本的理論依據(jù)，也預(yù)示著柑桔萜油在食品工業(yè)中將有著較為廣泛的發(fā)展前景。因此，對(duì)柑桔萜油進(jìn)行分離、純化，進(jìn)而開發(fā)成一種天然防腐劑，是本實(shí)驗(yàn)下一步有待開展的工作，其具有一定的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

［1］程紹南.柑桔對(duì)人體的生理調(diào)節(jié)機(jī)能［J］.中國(guó)柑桔，1994（1）：18-20.

［2］孫凌峰，劉秀娟，葉文峰，等.柑桔油和芋烯的性質(zhì)及制取方法［J］.林產(chǎn)化工通訊，2000（6）：19-23.

［3］李于善，賀艷，鄧靜，等.柑桔精油中d-芋烯的轉(zhuǎn)化研究［J］.香料香精化妝品，2004（5）：10-12.

［4］楊海燕，郭麗，傅力.辣椒堿的抗菌研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004（4）：63-66.

［5］吳周和，劉建成，吳小剛.藿香中天然防腐劑的提取方法及其抑菌作用研究［J］.中國(guó)調(diào)味品，2004（8）：18-20.

［6］樊黎生.蘆薈汁抗菌作用研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2001（8）：38-40.

［7］李學(xué)紅，馬慶一，彭雪萍.香辛料抑菌活性研究及其在草莓保鮮中的應(yīng)用［J］.食品研究與開發(fā)，2003（1）：96-99.

［8］顧仁勇，張麗，傅偉昌，等.芭蕉汁的抑菌作用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005（3）：57-59.

Study on the bacteriostasis of d-limonene

LI Xue-ling，GUO Li
（College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Bacteriostasis experimentation causing by d-limonene acting on some main spoilage organisms in food were determined by means of filter paper，and confirmed its MlC acting on these microorganisms，and the influences of pH and high temperature on d-limonene bacteriostasis were also studied.The results showed that dlimonene was a broad-spectrum antimicrobial，especially to fungus.ln addition，as to d-limonene bacteriostasis，the range of active pH was 5～9 for spoilage organisms in food and d-limonene had strong heat stability.

d-limonene；bacteriostasis

TS255.1

A

1002-0306（2010）12-0080-03

2009-09-16

李雪玲（1972-），女，講師，主要從事天然產(chǎn)物分離純化及功能性的研究。

安徽省農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目（las200503）。