解西玉，曾柏全，周小芹，許 志，宋 睿

（中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410004）

曲酸生產(chǎn)菌的60CO-γ射線(xiàn)誘變選育及表征

解西玉，曾柏全*，周小芹，許 志，宋 睿

（中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410004）

為了獲得高產(chǎn)曲酸菌株，采用不同劑量60Co-γ射線(xiàn)對(duì)出發(fā)菌株米曲霉進(jìn)行輻射誘變處理。結(jié)果表明，當(dāng)60Coγ射線(xiàn)輻射劑量為800Gy時(shí)，對(duì)出發(fā)菌株的誘變效果最好，使突變菌株C8-128的曲酸產(chǎn)量由出發(fā)菌株的15.68g/L增加到61.5g/L，產(chǎn)量提高292.2%，經(jīng)遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，得出其有良好的遺傳穩(wěn)定性，產(chǎn)酸能力穩(wěn)定。將篩選出的高產(chǎn)曲酸菌株C8-128通過(guò)菌落形態(tài)和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)特征與親株進(jìn)行比較，得出出發(fā)菌株經(jīng)60Co-γ射線(xiàn)輻射誘變后產(chǎn)生的一些特征性變化。

60Co-γ射線(xiàn)，曲酸，米曲霉，誘變，表征

曲酸（kojic acid），化學(xué)名α-羥甲基-5-羥基γ-吡喃酮，是由微生物好氧發(fā)酵產(chǎn)生的具有殺菌作用的次級(jí)代謝產(chǎn)物［1-4］；是由葡萄糖未經(jīng)碳架斷裂［5］，直接氧化脫水而成。該化合物作為美白祛斑劑、防腐劑、止痛劑、抗紫外線(xiàn)輻射劑、殺蟲(chóng)劑等被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等多個(gè)領(lǐng)域［6-8］；此外，曲酸還可作為合成生物可降解塑料的原材料［9］、香料合成的中間體等。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，由于曲酸的廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外很多著名學(xué)者都對(duì)曲酸的發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行了廣泛而深入的研究，并取得了一定進(jìn)展。60Co-γ射線(xiàn)是電離生物學(xué)上應(yīng)用最廣泛的電離射線(xiàn)之一［10］，它能引起水和其他物質(zhì)的離子化，從而產(chǎn)生間接的誘變效應(yīng)［11］，此法具有突變率高、后代性狀穩(wěn)定、育種周期短等優(yōu)點(diǎn)［12］。本研究通過(guò)利用60Co-γ射線(xiàn)對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行誘變選育，旨在降低曲酸生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，為曲酸的工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

米曲霉（Aspergillums oryzae） 由本生物工程實(shí)驗(yàn)室從霉變的冰糖橙皮上篩選獲得；曲酸標(biāo)準(zhǔn)樣品德國(guó)Riedel-de Haen公司，分析純；斜面保藏培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；活化培養(yǎng)基 葡萄糖10%、酵母膏0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.25%，pH6.0；篩選培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基中加入0.1%FeCl3；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖10%、酵母膏0.25%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.25%，pH 6.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定方法

1.2.1.1 曲酸含量測(cè)定 采用Fe3+-HCl［13］法。

1.2.1.2 生物量的測(cè)定 取 50mL發(fā)酵液離心（5000r/min，20min），收集濕菌體，置60℃下恒溫干燥至恒重（M），用稱(chēng)重法測(cè)定其生物量，生物量（g/L）=M×20

1.2.2 誘變方法

1.2.2.1 孢子懸液的制備 用生理鹽水將出發(fā)菌株斜面上的孢子洗下，倒入裝有玻璃珠的250mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速180r/min的旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)30min，待孢子分散成單個(gè)孢子后用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，得單孢子懸浮液。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為106個(gè)/mL。

1.2.2.260Co-γ射線(xiàn)誘變 20mL孢子懸液于50mL無(wú)菌三角瓶中，在湖南原子能研究所，分別以400、600、800、1000Gy的γ射線(xiàn)輻射劑量對(duì)其進(jìn)行輻射誘變處理。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵 挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)5d的出發(fā)菌株孢子于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，置于轉(zhuǎn)速為200r/min的旋轉(zhuǎn)式搖床上，恒溫30℃發(fā)酵培養(yǎng)7d。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ射線(xiàn)對(duì)出發(fā)菌株致死率和突變率的影響

一切誘變劑都具有殺菌和誘變雙重效應(yīng)，因此確定射線(xiàn)輻射誘變后菌株的致死率和突變率顯得很有必要。γ射線(xiàn)輻射后的菌懸液適當(dāng)梯度稀釋涂布平板后培養(yǎng)3d，以未照射菌懸液作為對(duì)照，計(jì)算在不同γ射線(xiàn)輻射劑量下輻照后的孢子致死率。分別挑取各不同γ射線(xiàn)輻射劑量誘變后的菌株50株，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，測(cè)其曲酸產(chǎn)量。規(guī)定產(chǎn)酸能力超過(guò)出發(fā)菌株5%及以上的突變株為正突變株，產(chǎn)酸能力低于出發(fā)菌株5%以下的菌株為負(fù)突變株，計(jì)算各不同γ射線(xiàn)輻射劑量照射下的正突變率和負(fù)突變率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同γ射線(xiàn)輻射劑量下的致死率和突變率

從圖1可以看出，γ射線(xiàn)對(duì)此菌株有較好的誘變效應(yīng)。致死率與射線(xiàn)輻射劑量成正比關(guān)系，即輻射劑量越大，菌株致死率越高。在低劑量范圍內(nèi)，孢子存活率較高，突變率隨射線(xiàn)輻射劑量的增大而增大，當(dāng)輻射劑量為800Gy時(shí)，殺菌率為81.6%，正突變率達(dá)最大值54.7%，但當(dāng)劑量為1000Gy時(shí)，正突變率卻迅速降低為6.8%，而負(fù)突變率卻升為最大，由此確定γ射線(xiàn)對(duì)此出發(fā)菌株的最佳誘變劑量為800Gy。

2.2 γ射線(xiàn)誘變對(duì)曲酸產(chǎn)量的影響

選取800Gy γ射線(xiàn)輻射劑量下R值（變色圈直徑與菌落直徑的比值）較大，且紅色暈圈顏色較深的200株單菌落接種于斜面培養(yǎng)，并進(jìn)行反復(fù)發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，最終將產(chǎn)酸能力較高的突變株列出，見(jiàn)表1。

表1 曲酸產(chǎn)量較高的突變株

由表1可以看出，γ射線(xiàn)的輻射劑量為800Gy時(shí)，對(duì)出發(fā)菌株有非常好的誘變效應(yīng)，這說(shuō)明從冰糖橙皮上分離出的野生型菌株對(duì)γ射線(xiàn)有較強(qiáng)的敏感性。其中，產(chǎn)酸量最高的菌株C8-128可以產(chǎn)生曲酸61.5g/L，產(chǎn)量提高292.2%。

2.3 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將上述4株突變株傳代六次，并對(duì)每一代菌株都進(jìn)行搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，突變株C8-128有較高的遺傳穩(wěn)定性，每一代菌株的曲酸產(chǎn)量都能維持在穩(wěn)定范圍內(nèi)。

2.4 突變株與親株的比較

2.4.1 突變株與親株的菌落形態(tài)比較 由圖2、圖3可以看出，突變株C8-128的菌落直徑小于親株，且生長(zhǎng)速度稍慢；但突變株C8-128在生長(zhǎng)早期即能產(chǎn)生大量曲酸（為了既不影響菌落形態(tài)的觀(guān)察又不影響紅色暈圈的觀(guān)察，此平板培養(yǎng)基中只加入0.001%的FeCl3）。此結(jié)果符合以往經(jīng)驗(yàn)，即菌物體生長(zhǎng)越旺盛，產(chǎn)物的生成量越少。

圖2 突變株

圖3 親株

2.4.2 突變株與親株的搖瓶發(fā)酵特征比較 由表2可以看出，突變株C8-128搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)時(shí)，其菌絲球比親株的菌絲球小1倍多，使培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分到菌球體內(nèi)部的物質(zhì)傳遞受限度變??；發(fā)酵液的粘稠度也比親株小很多，此優(yōu)勢(shì)增加了氧溶解和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞速率，同時(shí)也能使培養(yǎng)液的后處理變得更加容易；終pH比親株的更接近空白培養(yǎng)基的pH（在同樣條件下，未接入菌體的發(fā)酵培養(yǎng)基在旋轉(zhuǎn)搖床上旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)相同時(shí)間后的培養(yǎng)基為空白培養(yǎng)基，其終pH為5.11），這說(shuō)明，突變株在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中能維持較高pH環(huán)境，因?yàn)檫^(guò)低的pH環(huán)境不利于產(chǎn)物的生成；生物量是親株的3倍多，與以往記載相吻合，即在一定條件下，生物量越多，菌株產(chǎn)生的目的產(chǎn)物也越多。

表2 突變株與親株搖瓶發(fā)酵特征

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)表明，γ射線(xiàn)誘變米曲霉產(chǎn)生曲酸是有效的，不僅在曲酸得率上有較大提高，而且菌株的培養(yǎng)特征也有所變化，其最佳輻射誘變劑量為800Gy。本實(shí)驗(yàn)篩選到的高產(chǎn)曲酸菌株C8-128的曲酸產(chǎn)量比親株提高了292.2%，最終產(chǎn)量達(dá)到了61.5g/L，經(jīng)6代穩(wěn)定性遺傳實(shí)驗(yàn)，確定其產(chǎn)酸能力能維持在一個(gè)恒定的水平。通過(guò)對(duì)突變株C8-128的菌落形態(tài)的觀(guān)察，及搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)時(shí)的一些培養(yǎng)特征，得出突變株的優(yōu)越性：菌落在平板上長(zhǎng)出的菌落大小適中，生長(zhǎng)早期即能產(chǎn)生大量曲酸；搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)時(shí)菌絲球較小，發(fā)酵液粘稠度小，終pH能維持在有利于曲酸生成的較高pH水平，生物量也比出發(fā)菌株多。

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Study on60Co-γ irradiation mutation breeding of kojic acid production strain and its characterization

XIE Xi-yu，ZENG Bai-quan*，ZHOU Xiao-qin，XU Zhi，SONG Rui
（College of Life Science，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China）

Asperqillus oryzae were irradiated by different doses of60Co-γ rays to obtain high-yielding strains of kojic acid.The results indicated that，when the dose of the60Co-γ rays was 800Gy，it could have the best mutation effect to the start strain.The kojic acid yield of the mutant increased from original 15.68g/L to 61.5g/L，increased by 292.2%.lt had a good genetic stability and stably acid producing.To obtain the characteristics changes of the C8-128 which has a high yielding of kojic acid，it was compared to the starting strain in colony morphology and fermentation characteristics in flask.

60Co-γ ray；kojic acid；Asperqillus oryzae；mutation；characterization

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0212-03

2009-11-23 *通訊聯(lián)系人

解西玉（1986-），女，在讀碩士，從事微生物發(fā)酵方面的研究。