王秀娟，魯 丹，王玉華

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

不同菌種發(fā)酵綠茶對其茶多酚及咖啡堿含量影響的研究

王秀娟，魯 丹，王玉華*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

分別以保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌三種菌種為生產(chǎn)菌株，以脫脂乳為培養(yǎng)基，茶汁添加量分別為20%、30%、40%。在37℃恒溫條件下經(jīng)6、12、18、24、36、48h發(fā)酵后，以紫外分光光度法測定其中茶多酚以及咖啡堿的含量。當(dāng)茶汁添加量為30%，以保加利亞乳桿菌發(fā)酵12～18h時(shí)，培養(yǎng)基中茶多酚含量的增加速率最快。當(dāng)茶汁添加量為30%，以嗜酸乳桿菌發(fā)酵12～18h時(shí)，咖啡堿含量達(dá)最大值。

乳酸菌，茶，茶多酚，咖啡堿

茶多酚（tea polyphenols，簡稱TP），是茶葉中特有的一組以兒茶素類化合物為主的多酚類化合物，是一種具有優(yōu)越抗氧化性能的天然抗氧化劑［1］，其抗氧化指數(shù)是混合維生素E抗氧化指數(shù)的10～20倍。咖啡堿是茶葉中嘌呤類物質(zhì)，屬生物堿類物質(zhì)。茶多酚具有抗癌、抗衰老、抗輻射、清除人體自由基、改變腸道微生物的分布、降血糖、降血壓、降血脂及殺菌消炎等一系列藥理功能［2］?？Х葔A具有興奮中樞神經(jīng)、提神、恢復(fù)疲勞、強(qiáng)心活血、提高循環(huán)系統(tǒng)功能、抗衰老、利尿、抗癌、抗病毒等作用。近年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚具有抗腫瘤、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、強(qiáng)心、抗心律失常、抗衰老和抗菌等多種生物活性，并且揭示這些生物活性均與其抗氧化作用有關(guān)［3］。日本研究表明，茶多酚具有抑制α-苯并芘、黃曲霉素等致癌物質(zhì)的致突變作用，能防止人體腫瘤發(fā)生。俄羅斯研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚對胃癌及曲型增生的N-亞硝基脯氨酸的形成均具有明顯阻斷作用［4］。茶葉咖啡堿在醫(yī)藥上多用作興奮劑、強(qiáng)心劑、利尿劑和麻醉劑，也被廣泛用于臨床上的鎮(zhèn)痛、止血領(lǐng)域。現(xiàn)在咖啡堿也常與解熱鎮(zhèn)痛藥配伍以增強(qiáng)其鎮(zhèn)痛效果，與麥角胺合用來治療偏頭痛，與溴化物合用治療神經(jīng)衰弱。由于其具有極強(qiáng)的舒張支氣管平滑肌的作用，目前在哮喘病的治療中已被用作一種支氣管擴(kuò)張劑［5］。本文以脫脂乳為培養(yǎng)基，添加適量茶汁，分別接種保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌，嗜酸乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵，觀察三種乳酸菌對茶多酚和咖啡堿的含量變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

綠茶 市售，香氣符合綠茶的品質(zhì)要求，無霉變，無異味；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌 本研究室保存；其它試劑 均為國產(chǎn)試劑級。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌菌種的制備 取80μL菌種接種于5mL滅菌后的脫脂乳培養(yǎng)基中，在40℃溫度條件下恒溫培養(yǎng)，經(jīng)4～5h左右凝乳后，取出冷藏保存。

1.2.2 綠茶浸提汁的制備 采用微波浸提法。取6g磨碎茶樣于1000mL錐形瓶中，加入800mL 20℃蒸餾水，用密封帶密封瓶口，棉線繩系緊，在微波爐中以中檔功率加熱5min［6］，取出冷卻至70℃左右，用4層紗布中間夾一層脫脂棉過濾至1000mL容量瓶中，定容，冷卻至室溫。

1.2.3 綠茶發(fā)酵乳的制備 按20%、30%和40%添加量取綠茶汁與脫脂牛奶混合400mL分別置于1000mL三角燒瓶中，115℃，滅菌15min，冷卻后分別接種保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌，接種量均為5%，置于40±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在0、6、12、18、24、36、48h無菌條件下吸取50mL樣品冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 測定方法

1.2.4.1 茶多酚的測定 取搖勻后樣品25mL于50mL容量瓶中，加入95%乙醇15mL，充分搖勻，放置15min后，用水定容至刻度。用慢速定量濾紙過濾，濾液備用。

精確移取上述濾液5mL于25mL容量瓶中，加4mL水、5mL酒石酸亞鐵溶液，充分搖勻，用pH7.5磷酸緩沖溶液定容至刻度。測定其波長540nm處吸光度（A1）。同時(shí)取等量濾液于25mL容量瓶中，加4mL水，用pH7.5的磷酸緩沖液定容至刻度，測定其吸光度（A2）。

樣品中茶多酚的含量由式（1）計(jì)算：

式中：X，樣品中茶多酚的含量，mg/L；A1，濾液顯色后的吸光度；A2，濾液底色的吸光度；K，稀釋倍數(shù)；V，測定時(shí)吸取濾液的體積，mL；1.957，當(dāng)吸光度等于 0.50時(shí)，1mL茶汁中茶多酚的含量相當(dāng)于1.957mg。

1.2.4.2 咖啡堿的測定 用移液管準(zhǔn)確吸取樣品20.0mL，移入250mL容量瓶中，加入10mL 0.01mol/L鹽酸和2mL堿性醋酸鉛溶液（堿式醋酸鉛作為沉淀劑，除去茶多酚、蛋白質(zhì)及色素等物質(zhì)），用水稀釋至刻度，充分混勻，靜置過濾。準(zhǔn)確吸取濾液50.00mL濾液注入100mL容量瓶中，加入0.2mL 4.5mol/L硫酸溶液，加水稀釋至刻度、混勻、靜置過濾。測定其波長272nm處吸光度［7-10］。每毫升含1μg標(biāo)準(zhǔn)咖啡堿的樣液在272nm處測得的吸光度值為0.052，因此計(jì)算每毫升該溶液內(nèi)含咖啡堿的微克數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌發(fā)酵綠茶的茶多酚含量變化分析

將保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌分別接種含茶汁20%、30%和40%的脫脂乳，于37℃發(fā)酵，分別于不同時(shí)間取樣觀察其茶多酚的含量，結(jié)果見圖1。

由圖1A可見，所有培養(yǎng)基樣液中茶多酚的含量均在發(fā)酵12～18h時(shí)增加速度最快，茶浸提汁添加量在30%時(shí)茶多酚含量的增加速率最明顯。由圖1B可見，所有培養(yǎng)基樣液中茶多酚的含量均在發(fā)酵18～24h時(shí)增加速度最快，茶浸提汁添加量在20%和30%時(shí)茶多酚含量的增加速率最明顯。由圖1C可見，所有培養(yǎng)基樣液中茶多酚的含量在發(fā)酵過程中增加速度基本相似，茶浸提汁添加量在30%時(shí)茶多酚含量的增加速率較明顯。

圖1 不同乳酸菌發(fā)酵含綠茶汁乳液茶多酚的變化

培養(yǎng)基樣液中茶多酚的含量在發(fā)酵12～18h時(shí)增加速度最快，茶浸提汁添加量在30%時(shí)效果明顯，而以保加利亞乳桿菌為實(shí)驗(yàn)菌種、茶浸提汁添加量為30%，發(fā)酵12～18h時(shí)茶多酚含量的增加速率最為顯著。而后的18～48h間菌種處于成熟期和衰亡期，影響了發(fā)酵速率，降低了茶多酚產(chǎn)量。

2.2 不同乳酸菌發(fā)酵綠茶的咖啡堿含量變化分析

將保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌分別接種含茶汁20%、30%和40%的脫脂乳，于37℃發(fā)酵，分別于不同時(shí)間取樣觀察其咖啡堿的含量，結(jié)果見圖2。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵含綠茶汁乳液咖啡堿的變化

由圖2A可見，所有培養(yǎng)基樣液在發(fā)酵12～18h時(shí)所取樣的咖啡堿含量呈遞增趨勢，18h含量最多。添加茶浸提汁為40%的培養(yǎng)基樣液在發(fā)酵12～18h時(shí)達(dá)到咖啡堿的含量最大，可見以保加利亞乳桿菌為菌種發(fā)酵時(shí)，茶浸提汁添加量為40%的培養(yǎng)基為最優(yōu)配比培養(yǎng)基。由圖2B可見，所有培養(yǎng)基樣液在發(fā)酵12～18h時(shí)所取樣的咖啡堿含量呈遞增趨勢，18h時(shí)含量最多。添加茶浸提汁為30%的培養(yǎng)基樣液在發(fā)酵12～18h時(shí)達(dá)到咖啡堿的最大含量，可見以嗜熱鏈球菌為菌種發(fā)酵時(shí)，茶浸提汁添加量為30%的培養(yǎng)基為最優(yōu)配比培養(yǎng)基。由圖2C可知，所有培養(yǎng)基樣液在發(fā)酵12～24h時(shí)所取樣的咖啡堿含量呈遞增趨勢，24h含量最多。添加茶浸提汁為30%的培養(yǎng)基樣液在發(fā)酵12～18h時(shí)達(dá)到咖啡堿的最大含量，可見當(dāng)以嗜酸乳桿菌為菌種發(fā)酵時(shí)，茶浸提汁添加量為30%的培養(yǎng)基為最優(yōu)配比培養(yǎng)基。

幾乎所有培養(yǎng)基樣液中在發(fā)酵12～24h時(shí)所取樣的咖啡堿含量最多。添加茶浸提汁為40%的培養(yǎng)基樣液在發(fā)酵12～24h時(shí)均達(dá)到咖啡堿的最大含量，可見茶浸提汁添加量為40%的培養(yǎng)基為最優(yōu)配比培養(yǎng)基。其中以嗜酸乳桿菌為菌種發(fā)酵的添加茶浸提汁為30%的培養(yǎng)基中在發(fā)酵18～24h時(shí)所取樣的咖啡堿含量最多。在發(fā)酵24～48h時(shí)培養(yǎng)基樣液中的咖啡堿含量均有不同程度的減少，可能由于微生物代謝產(chǎn)物的積累及微生物即將進(jìn)入衰亡期而影響了咖啡堿的分解。

3 結(jié)論

以保加利亞乳桿菌為發(fā)酵菌種，以茶浸提汁添加量為30%的脫脂乳為培養(yǎng)基發(fā)酵12～18h時(shí)培養(yǎng)基中茶多酚含量的增加速率最快。以嗜酸乳桿菌為發(fā)酵菌種，以茶浸提汁添加量為30%的培養(yǎng)基在發(fā)酵18～24h時(shí)培養(yǎng)基中咖啡堿含量最多。我們可以通過此方法以最少的生產(chǎn)材料生產(chǎn)出大量的茶多酚和咖啡堿，應(yīng)用到食品、醫(yī)療以及化妝品等行業(yè)中，為以后的研究開發(fā)打下基礎(chǔ)。

［1］GB12493-90（04.005）茶多酚［S］.

［2］Xi jun，Shen Deji，Zhao Shou，et al.Characterization of polyphenols from green tea leaves using a high hydrostatic pressure extraction［J］.International Journal of Pharmaceutics，2009，382（1-2）：139-143.

［3］陳繼英，郭嘉林，張存彥，等.茶多酚的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2004（10）：16-19.

［4］阮棟梁，張英峰，王豐玲，等.茶多酚的提取和應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.渤海大學(xué)學(xué)報(bào)，2007（3）：6-11.

［5］楊巍.咖啡堿的藥理作用與開發(fā)利用前景［J］.茶葉科學(xué)技術(shù)，2006（4）：9-11.

［6］寧井銘，周天山，方世輝，等.綠茶飲料不同浸提方式研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，31（3）：288-291.

［7］程慧青，肖荔人，林云珠，等.微波法提取茶多酚工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)［J］.福建農(nóng)業(yè)科技，2006（4）：51-53.

［8］譚和平，葉善蓉，鄒燕，等.茶葉中生物堿的分析方法概述［J］.中國測試技術(shù)，2008（9）：5-9.

［9］Pan Xuejun，Niu Guoguang，Liu Huizhou.Microwave-assisted extraction of tea polyphenols and tea caffeine from green tea leaves［J］.Chemical Engineering and Processing，2003，42（2）：129-133.

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Effect of different bacteria fermented tea on polyphenols and caffeine

WANG Xiu-juan，LU Dan，WANG Yu-hua*
（Food Science and Engineering College，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

The skim milk with 20%，30% and 40% tea were fermented using Lactobacillus burglarious，Streptococcus thermopiles and Lactobacillus acidophilus，respectively.After 6，12，18，24，36，48h fermentation at 37℃in constant temperature，the content of the caffeine was determined with spectrophotometer.When the tea was added 30%to ferment with Lactobacillus burglarious for 12～18h，the increase rate of tea polyphones in medium was the fastest.When the tea was added 30%to ferment with Lactobacillus acidophilus for 12～18h，the caffeine content was the maximum.

Lactobacillus；tea；tea polyphenols；caffeine

TS272.5+1

A

1002-0306（2010）12-0200-03

2009-12-30 *通訊聯(lián)系人

王秀娟（1982-），女，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事食品微生物學(xué)及功能性食品研究。

吉林省農(nóng)業(yè)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（200302-02）。