魏彩霞,謝俊峰 ,高媛媛 ,楊 靜,趙惠茹
(1.西安醫(yī)學(xué)院,陜西 西安 710021; 2.寧夏回族自治區(qū)隆德縣人民醫(yī)院,寧夏 固原 756004)
槐米為豆科植物槐 Sophora japonica L.的干燥花及花蕾,是我國(guó)目前蘆丁的主要生產(chǎn)原料。蘆丁是槲皮素C3位的羥基和蕓香糖結(jié)合而形成的雙糖苷,在熱水、熱醇中均有較大的溶解度;分子中含有多個(gè)酚羥基,呈弱酸性,易溶于堿水。蘆丁常用的提取溶劑有水、醇、冷堿、熱堿,提取方法有水煎煮法、連續(xù)回流法、熱堿提取法、超聲提取法等。水煎煮法簡(jiǎn)單易行,造價(jià)低,但蘆丁的收率低;連續(xù)回流法要用大量有機(jī)溶劑,生產(chǎn)成本高;熱堿提取法因堿水提取時(shí)需加熱,容易破壞蘆丁的結(jié)構(gòu)。也有采用微波法和超聲法提取槐米中蘆丁的報(bào)道,以微波法為輔助堿溶酸沉提取、連續(xù)回流提取[1],需特殊裝置,且操作較麻煩。本試驗(yàn)以槐米為原料,采用超聲法和堿溶酸沉法相結(jié)合,在提取功率、超聲提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比等單因素考察試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交設(shè)計(jì)法對(duì)超聲提取時(shí)間、提取溫度、料液比進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn),確定了超聲法提取蘆丁的最佳提取工藝?,F(xiàn)報(bào)道如下。
弘祥隆牌DCTZ-2000型三頻多用途恒溫超聲提取機(jī)(北京弘祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);100-2型電子天平(上海天平儀器廠);SB52000T型超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);101-1型干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠)。硼砂、氫氧化鈉、濃鹽酸均為分析純;槐米(干品,購(gòu)自好一生醫(yī)藥超市)。
槐米→粉碎→石灰乳調(diào)pH(pH為8~9[2])→超聲提取→過(guò)濾→濾液加鹽酸調(diào)pH(pH為2~3)→靜置→過(guò)濾→沉淀干燥→蘆丁粗提物→加蒸餾水(1∶200)→煮沸10 min→趁熱抽濾→濾液靜置→抽濾→沉淀干燥→稱重→計(jì)算收率。收率=精制后所得蘆丁的質(zhì)量(g)/槐米粗粉的質(zhì)量(g)×100%。
超聲功率選擇:固定料液比為1∶30,超聲頻率為20 kHz,室溫,超聲提取 20 min,提取2次,以超聲功率分別為200,400,600,800,1 000 W進(jìn)行超聲提取。結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn),隨著超聲功率的增加,收率不斷增加,1 000 W時(shí)收率最高。這主要是因?yàn)樘J丁為槐米細(xì)胞中的次生代謝產(chǎn)物,存在于槐米細(xì)胞質(zhì)中,破壞槐米的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜會(huì)使蘆丁更容易被提取出來(lái)。當(dāng)超聲功率較低時(shí),超聲強(qiáng)度沒(méi)有達(dá)到空化閥聲壓,很難產(chǎn)生空化作用,隨著超聲功率增加,超聲強(qiáng)度達(dá)到或超過(guò)了空化閥聲壓時(shí),空化作用明顯,故收率增加。
超聲提取時(shí)間選擇:固定超聲功率800 W,料液比1∶30,超聲頻率為 20 kHz,室溫,以超聲提取時(shí)間為 5,10,20,30,40 min 進(jìn)行超聲提取,提取2次。結(jié)果見(jiàn)表1??梢?jiàn),提取時(shí)間為5~30 min時(shí),隨著提取時(shí)間的增加,收率不斷增加,但35 min時(shí)提取率并未增加,反而略有減小。主要原因是超聲波輻射時(shí)間過(guò)短,不能有效破壞原料的細(xì)胞壁;但如果超聲作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng),蘆丁被氧化的量就越大,收率反而不再增加甚至減小。
超聲提取次數(shù)選擇:固定超聲功率800 W,料液比1∶30,超聲頻率 20 kHz,室溫,超聲提取 20 min,分別提取 1次、2次、3次、4次、5次。結(jié)果見(jiàn)表1??梢?jiàn),超聲提取2次時(shí)收率最高,提取次數(shù)超過(guò)2次后,提取次數(shù)越多,收率反而下降。
料液比選擇:固定超聲功率800 W,超聲頻率20 kHz,室溫,提取 20 min,提取 2 次,分別以料液比 1 ∶10,1 ∶15,1 ∶20,1 ∶25,1 ∶30 進(jìn)行超聲提取。結(jié)果見(jiàn)表 1??梢?jiàn),料液比為 1 ∶10,1 ∶15,1 ∶20時(shí),隨著提取溶劑量的增加,收率也在增加,1∶20時(shí)收率最高;此后,隨著提取溶劑量的增加,收率反而呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著提取溶劑量的增加,蘆丁提取越完全,收率會(huì)逐漸增加,但溶劑量越大,蘆丁在溶劑中的溶解量也會(huì)增加,使收率下降;另一方面,提取溶劑量過(guò)高會(huì)影響超聲波的輻射強(qiáng)度,從而使植物的細(xì)胞壁破碎受阻,導(dǎo)致收率降低。料液比過(guò)低時(shí),超聲破碎槐米的細(xì)胞壁后不能使蘆丁成分充分地浸溶于溶劑,當(dāng)提取液達(dá)到飽和時(shí),溶劑不足以把物料中的有效成分全部提取出來(lái)。因此,提取過(guò)程中合適的料液比有待進(jìn)一步考察。
溫度選擇:固定超聲功率800W,超聲頻率20kHz,提取20min,提取2次,分別以溫度 20,30,40,50,60℃進(jìn)行超聲提取。結(jié)果見(jiàn)表1??梢?jiàn),提取溫度越高,收率也上升,但溫度達(dá)到一定值時(shí)收率上升的趨勢(shì)變得平緩。一般來(lái)講,提取溫度越高,藥材中化學(xué)成分的擴(kuò)散速度會(huì)越快,但溫度過(guò)高時(shí)提取的雜質(zhì)也會(huì)增多。
表1 單因素考察試驗(yàn)結(jié)果
固定超聲功率800W,頻率20kHz,提取2次,以提取時(shí)間(因素 A)、提取溫度(因素 B)和料液比(因素C)為考察因素,進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)。因素水平見(jiàn)表2,試驗(yàn)結(jié)果與方差分析見(jiàn)表3及表4。由極差和方差分析可知,各因素對(duì)蘆丁收率的影響主次順序不一致。由表3中 R值大小可以看出,各因素影響收率的程度大小順序?yàn)锳>C>B,即最大影響因素為提取時(shí)間,其次是料液比,溫度影響最小。由表4可見(jiàn),提取時(shí)間對(duì)蘆丁的收率有顯著影響,而料液比和溫度的影響不顯著。綜合考慮,各因素的最佳組合為A1B2C3,即超聲頻率為20kHz,功率800W,提取時(shí)間為30min,提取溫度60℃,料液比為 1∶20。
隨著超聲功率的增加,蘆丁的收率也不斷增加,但由于試驗(yàn)儀器條件的限制和為了保護(hù)超聲提取儀,并沒(méi)有進(jìn)行超聲功率大于1000W條件下槐米中蘆丁提取效果的考察,故單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)均選擇800W功率進(jìn)行超聲提取。超聲提取時(shí)間越大,收率也越大,但提取時(shí)間越長(zhǎng),雜質(zhì)就會(huì)相對(duì)增加;而且超聲提取到一定程度(有效成分被提取得近乎完全)時(shí),收率并不會(huì)隨著提取時(shí)間的增加而增加,而是會(huì)穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。因此,在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,正交設(shè)計(jì)時(shí)選擇提取時(shí)間作為考察因素之一,并且選擇10,20,30min3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明,提取次數(shù)在2~3次時(shí),有效成分即可被完全提取。一般而言,提取次數(shù)越多,雜質(zhì)就會(huì)越多。本試驗(yàn)以水為介質(zhì),提取溫度升高,水中的小氣泡也增多,這對(duì)空化作用是有利的,但溫度過(guò)高,氣泡中的蒸氣壓太高會(huì)使得氣泡閉合時(shí)緩沖作用增強(qiáng),空化作用反而會(huì)減弱。不同溶劑的最適溫度是不相同的,一般由溶劑的特性而定。由于水的比熱容比較大,因此在設(shè)置提取溫度時(shí),各水平之間的間隔定為20℃。
表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表
表3 正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析
表4 因素方差分析表
雖然黃酮類物質(zhì)(除花色素外)因交叉共軛系統(tǒng)和苷上糖鏈的存在而具有一定的極性,但在水中較難溶解。大多數(shù)黃酮類物質(zhì)具有酚羥基,因此可以用堿性水或堿性醇浸出,再經(jīng)酸化而得。氫氧化鈉水溶液的浸出能力高,但雜質(zhì)較多,純化不便。石灰水可以使一些鞣質(zhì)或水溶性雜質(zhì)沉淀生成鈣鹽沉淀,有利于浸液純化。因此,本試驗(yàn)選擇石灰乳調(diào)節(jié)pH。
在超聲輔助條件下提取槐米中的蘆丁時(shí),適宜的超聲提取條件可提高蘆丁的產(chǎn)率。優(yōu)選的提取工藝條件簡(jiǎn)單可行、速度快,大大縮短了提取時(shí)間,且提高了有效成分的提出率和原料的利用率。
[1]郭 玉,唐國(guó)濤,陳淑嫻,等.槐花米中蘆丁提取方法的比較研究[J].中成藥,2007,29(11):1675-1677.
[2]舒曉宏,馮 梅,陳 華,等.槐花米中蘆丁提取最佳pH值得實(shí)驗(yàn)研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,27(2):91-92.