周向陽(yáng) ，鄧永文 ，方 芳，王 飛，宋 濤，方加勝

（1.郴州市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，湖南 郴州 423000；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 神經(jīng)外科，湖南 長(zhǎng)沙410000；3.湖南省人民醫(yī)院 神經(jīng)外科，湖南 長(zhǎng)沙 410000）

隨著近年來(lái)組織工程學(xué)的飛速發(fā)展，種子細(xì)胞的獲得作為組織工程學(xué)的第一大要素，已經(jīng)將重點(diǎn)放在了成體干細(xì)胞的研究上，數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的學(xué)者數(shù)十年來(lái)一直致力于理想干細(xì)胞的尋找工作。美國(guó)的ZUK等人在2001年提出了脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSC）的概念，將其向骨、軟骨、肌肉和脂肪細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化的研究也已取得了成功[1]。神經(jīng)組織包括的細(xì)胞種類(lèi)較復(fù)雜且涉及和神經(jīng)干細(xì)胞（NSC），而且鮮有這方面的研究，故ADSC是否真正能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞、分化后的細(xì)胞在形態(tài)和表型上會(huì)發(fā)生怎樣的變化尚需我們?nèi)ヌ剿鳌?/p>

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的體重180～200 g的健康SD大鼠（雌雄不限）

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基粉劑（美國(guó)Gibco Corp.），重組人表皮生長(zhǎng)因子（EGF）（PeproTech EC Ltd），重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）（PeproTech EC Ltd），B-巰基乙醇（BME）（PeproTech EC Ltd），左旋谷氨酰胺（Invitrogen Corp.），注射用胰島素（Amresco，Inc），二甲基亞砜（DMSO）（Amresco，Inc），左旋多聚賴(lài)氨酸（江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥有限公司），ABC法免疫組化試劑盒（武漢博士德公司），兔抗人GFAP多克隆抗體（武漢博士德公司），兔抗人NSE多克隆抗體（武漢博士德公司），小鼠抗人CD44單克隆抗體（武漢博士德公司），CY3標(biāo)記羊抗小鼠IgG（武漢博士德公司）。

1.3 脂肪組織的取材

取SD大鼠，麻醉滿意后取腹股溝和腹膜后脂肪組織膜后脂肪組織約3 g，置于無(wú)菌玻璃小瓶中并用PBS及青、鏈霉素溶液洗3遍。

1.4 ADSC的分離和原代培養(yǎng)

用眼科顯微剪將脂肪組織剪碎為1mm3大小；3 mL 1%Ⅰ型膠原酶加入已剪碎的脂肪組織中，37℃消化1 h，每10min搖晃1次；加入10mL 15%含血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化并稀釋?zhuān)徊讳P鋼篩網(wǎng)（74μm孔徑）過(guò)濾含ADSC濁液，濾去組織殘塊；離心管收集濾液，加入紅細(xì)胞裂解液2 mL后1 200 r/m離心15 s；離心后濾液分為3層，上層較薄為密度較低的白色泡沫狀脂質(zhì)層，中層為液體層，底層為細(xì)胞層，肉眼可見(jiàn)少許白色絮狀物；移去上層和中層，加入5mL 15%含血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基吹打重懸后，移入50mL塑料無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，相差倒置顯微鏡下觀察原代ADSC形態(tài)。

1.5 ADSC的傳代培養(yǎng)

原代ADSC置于5%二氧化碳、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d觀察1次并換培養(yǎng)液，觀察時(shí)擰緊瓶蓋，放入培養(yǎng)箱時(shí)稍松瓶蓋。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合后傳代，超凈工作臺(tái)內(nèi)倒去培養(yǎng)基，加入1mL 0.25%胰蛋白酶傾斜瓶底使其均勻覆蓋瓶底，1min后倒去胰蛋白酶并加入含血清培養(yǎng)基吹打瓶底細(xì)胞，相差倒置顯微鏡下觀察，直到大部分細(xì)胞回縮成球并與瓶底分離。按1︰2比例將細(xì)胞懸液移至另外2個(gè)50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，后3～4 d相同方法傳代1次，觀察ADSC形態(tài)。

1.6 ADSC表型鑒定干細(xì)胞標(biāo)志物CD44的表達(dá)

用免疫熒光法檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44在ADSC的表達(dá)情況，取第3代細(xì)胞胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，適宜密度接種于已用多聚賴(lài)氨酸包被的蓋玻片，置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后細(xì)胞貼壁并伸展完全，行免疫熒光染色：細(xì)胞爬片固定破膜后，BSA封閉，加入CD44一抗4℃過(guò)夜，Cy3標(biāo)記的二抗孵育1 h，封片后用短波長(zhǎng)藍(lán)色激發(fā)光觀察，并用數(shù)碼相機(jī)拍攝高倍鏡下（×200倍）細(xì)胞熒光表達(dá)情況。

1.7 ADSC的貼壁率的研究

取第3代生長(zhǎng)情況較好的ADSC細(xì)胞，同上法制成單細(xì)胞懸液，以2×105/孔密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。此后，每2 h共12次取其中3孔，移去培養(yǎng)液，將貼壁細(xì)胞制成懸液計(jì)數(shù)數(shù)量，按公式：貼壁率（%）=貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%計(jì)算三孔貼壁率和平均貼壁率。這些數(shù)據(jù)可以反映ADSC在接種后24 h內(nèi)的貼壁情況。

1.8 MTT比色實(shí)驗(yàn)測(cè)定ADSC生長(zhǎng)曲線

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶的甲贊，經(jīng)DMSO溶解后可測(cè)其光吸收值，利用MTT產(chǎn)物與細(xì)胞數(shù)成正比的關(guān)系檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。取第3代生長(zhǎng)情況較好的ADSC細(xì)胞，消化吹打制成單細(xì)胞懸液，以2×103/孔密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板并培養(yǎng)，根據(jù)貼壁率結(jié)果自接種后24 h，每天取出其中3孔進(jìn)行MTT比色直到細(xì)胞數(shù)減少。每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培基上清液，每孔加入150μL DMSO并震蕩10 s，使甲贊充分溶解。選擇492 nm波長(zhǎng)處在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值。以時(shí)間為橫軸，每次3孔的平均光吸收值繪制ADSC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.9 ADSC預(yù)誘導(dǎo)和誘導(dǎo)劑的配制

預(yù)誘導(dǎo)劑：NMPP+2 nmol/L BME+無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基 NMPP 成分：（DMEM）：HAMS F12（50︰50）+bFGF 20 ng/mL+EGF 20 ng/mL+N2；1︰100誘導(dǎo)劑：10 nmol/L BME+無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。

1.10 ADSC的誘導(dǎo)分化

分別取制備的細(xì)胞爬片2片用于誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化步驟：預(yù)誘導(dǎo)24 h+誘導(dǎo)劑5 h。分化過(guò)程中每隔數(shù)小時(shí)動(dòng)態(tài)觀察一次ADSC的形態(tài)，對(duì)誘導(dǎo)后的ADSC細(xì)胞爬片進(jìn)行NSE、GFAP免疫熒光染色，鑒定ADSC的分化結(jié)果。分別設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，用藍(lán)色激發(fā)光觀察GFAP染色情況，用綠色激發(fā)光觀察NSE染色情況。

1.11 ADSC分化過(guò)程中Nestin的動(dòng)態(tài)表達(dá)的半定量統(tǒng)計(jì)分析

取4片ADSC細(xì)胞爬片進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)，加入預(yù)誘導(dǎo)劑后，分別在第6、12、18和24 h取出其中的一片，對(duì)其進(jìn)行Nestin免疫組化染色：染色完畢后顯微鏡下觀察，尋找Nestin陽(yáng)性細(xì)胞。Nestin為細(xì)胞漿-細(xì)胞膜型表達(dá)方式，以細(xì)胞輪廓出現(xiàn)棕色染色為陽(yáng)性細(xì)胞。每個(gè)爬片隨機(jī)取5個(gè)非重疊高倍視野進(jìn)行Nestin陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)，并計(jì)算Nestin陽(yáng)性細(xì)胞率。結(jié)果用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，采用其中多個(gè)樣本率的χ2分割檢驗(yàn)法，根據(jù)要求計(jì)算檢驗(yàn)水準(zhǔn)P為0.007。

2 結(jié)果

2.1 ADSC細(xì)胞形態(tài)

剛從脂肪組織分離的原代ADSC細(xì)胞在相差倒置顯微鏡下呈單細(xì)胞懸浮狀態(tài)，體積較紅細(xì)胞大、橢圓形，胞核稍暗。觀察發(fā)現(xiàn)，原代接種3 h后開(kāi)始貼壁，并在48 h內(nèi)開(kāi)始伸展。約96 h完全伸展后，細(xì)胞形狀為細(xì)長(zhǎng)梭狀，胞核位于中央與胞漿對(duì)比明顯，嚴(yán)格按貼附方式生長(zhǎng)，此時(shí)在外形上和骨髓干細(xì)胞難以區(qū)別。細(xì)胞以集落形式增殖，7～8 d后細(xì)胞生長(zhǎng)匯合并停止生長(zhǎng)（圖1），每一代細(xì)胞之間無(wú)明顯形態(tài)學(xué)差異。

圖1 生長(zhǎng)匯合的ADSC，長(zhǎng)梭形，貼壁生長(zhǎng)（×200）

圖2 ADSC的CD44免疫熒光染色呈強(qiáng)陽(yáng)性（×200）

2.2 ADSC表達(dá)CD44

免疫熒光法檢測(cè)到ADSC強(qiáng)陽(yáng)表達(dá)CD44（圖2），為胞漿表達(dá)形式，細(xì)胞輪廓被熒光清晰襯托。

2.3 ADSC的貼壁率

表1 接種24 h內(nèi)ADSC的貼壁率

說(shuō)明傳代培養(yǎng)的ADSC能在接種后的24 h內(nèi)貼壁完全。

2.4 ADSC的生長(zhǎng)曲線

采用MTT法測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖3）較真實(shí)的反映了其生長(zhǎng)情況，從曲線上可以看出，ADSC生長(zhǎng)活躍，增殖能力強(qiáng)，具有對(duì)數(shù)生長(zhǎng)型的曲線模式且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期明顯。在完全貼壁第9天后，細(xì)胞數(shù)目不再增加，采用繪圖法得出其倍增時(shí)間為4 d。

圖3 ADSC生長(zhǎng)曲線

2.5 ADSC向神經(jīng)細(xì)胞的定向分化

ADSC在預(yù)誘導(dǎo)階段形態(tài)變化不明顯，在加入誘導(dǎo)劑后僅1 h，就可見(jiàn)部分細(xì)胞開(kāi)始由梭狀變?yōu)闄E圓形，并向周?chē)斐鰯?shù)個(gè)較長(zhǎng)突起（圖4），在誘導(dǎo)結(jié)束后，幾乎所有細(xì)胞均表現(xiàn)為神經(jīng)元的外形，突起明顯，細(xì)胞密度較誘導(dǎo)前變化不大，未見(jiàn)膠質(zhì)樣細(xì)胞。ADSC在分化結(jié)束后明顯表達(dá)NSE而不表達(dá)GFAP（圖 5）。檢測(cè) ADSC 預(yù)誘導(dǎo)后 6、12、18和 24 h Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的比例，結(jié)果用（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（±s）形式表達(dá)，以0.007為檢驗(yàn)水準(zhǔn)P，每?jī)蓚€(gè)率的均數(shù)分別行χ2檢驗(yàn)?？梢?jiàn)，Nestin陽(yáng)性細(xì)胞胞漿均勻呈棕色，與背景區(qū)別明顯，胞核清晰且便于計(jì)數(shù)（圖6），陰性和陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別，未見(jiàn)明顯非特異性著色。SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，P值均小于0.007，故認(rèn)為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞率差異有顯著性（表2）?？梢哉J(rèn)為，在預(yù)誘導(dǎo)ADSC向神經(jīng)細(xì)胞分化的過(guò)程中，逐漸減弱對(duì)標(biāo)志NSC的Nestin的表達(dá)，提示ADSC的分化機(jī)制中缺乏經(jīng)歷NSC再沿著后者的分化路徑分化的證據(jù)。

圖4 誘導(dǎo)1 h可見(jiàn)有細(xì)胞變?yōu)樯窠?jīng)元形態(tài)，并向周?chē)斐鐾黄穑ā?00）

圖5 誘導(dǎo)結(jié)束后，ADSC分化為神經(jīng)元強(qiáng)烈表達(dá) NSE（熒光染色）（×200）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)的Nestin陽(yáng)性率（±s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)的Nestin陽(yáng)性率（±s）

時(shí)間（h）612 18 24 Nestin陽(yáng)性率%21.83±1.99 16.51±2.73 12.68±1.39 9.80±2.78

圖6 ADSC預(yù)誘導(dǎo)6 h后Nestin免疫組化染色，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色（×200）

圖7 ADSC預(yù)誘導(dǎo)24 h后Nestin免疫組化染色，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色（×200）

3 討論

脂肪組織和骨髓同屬中胚層，科學(xué)家們渴望在脂肪中發(fā)現(xiàn)類(lèi)似骨髓干細(xì)胞的細(xì)胞。最早的研究是基于抽脂手術(shù)獲取的脂肪組織。普通的脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)中懸浮生長(zhǎng)，而有少部分梭狀呈貼附生長(zhǎng)的亞群有相當(dāng)?shù)姆至言鲋衬芰?，最早稱(chēng)其為脂肪組織提取細(xì)胞（processed-lipoaspirate cells，PLAC）。后來(lái)，逐漸明確其亦有多向分化的潛能。ZUK等人通過(guò)檢測(cè)相關(guān)分子的表達(dá)，排除了脂肪組織中存在軟骨、骨、肌細(xì)胞等存在的可能[1]。目前已有研究證實(shí)這是一類(lèi)全新的干細(xì)胞，稱(chēng)其為ADSC[2，3]。已證明ADSC穩(wěn)定表達(dá) HLA-ABC、CD44、CD106、CD166等分子[4]，但尚無(wú)特異性很高的表面標(biāo)志可用于鑒定，故對(duì)前者的認(rèn)定需結(jié)合其活躍穩(wěn)定的增殖能力、多向的分化潛能和CD44等干細(xì)胞所普遍表達(dá)的表面分子等多方面因素綜合考慮。

ADSC取材于細(xì)胞成分單純的脂肪組織，可以在持續(xù)自我復(fù)制增殖和傳代。CD44是目前所發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞最廣泛表達(dá)的標(biāo)志物[5]，分布于胞膜和胞漿，它的存在可以進(jìn)一步證明干細(xì)胞的身份。盡管對(duì)于干細(xì)胞的定義不強(qiáng)調(diào)細(xì)胞的表型，但對(duì)于其表型的研究可以為我們?cè)诩?xì)胞篩選、探究細(xì)胞亞群等工作中提供幫助。實(shí)驗(yàn)中觀察到ADSC強(qiáng)烈表達(dá)CD44，可以回顧性的支持對(duì)于ADSC干細(xì)胞的命名。貼壁率和生長(zhǎng)曲線是細(xì)胞生長(zhǎng)特征的重要指標(biāo)，在傳代后24 h其貼壁率為96.6%，其貼壁速度之快和效率之高遠(yuǎn)超過(guò)大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞。在后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)工作中，可以充分利用這種特點(diǎn)，即在傳代后不久就可行其它處理，為我們提高工作效率提供了理論的支持。ADSC的生長(zhǎng)過(guò)程呈典型的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，三個(gè)生長(zhǎng)階段明顯對(duì)稱(chēng)，其倍增時(shí)間僅4 d，足以襯托其分裂的高效率。也能夠解釋在將ADSC向神經(jīng)細(xì)胞預(yù)誘導(dǎo)時(shí)，絲裂原bFGF可以在短期內(nèi)使ADSC數(shù)量明顯增加。

美國(guó)加利福尼亞大學(xué)的ZUK等人于2001年最早嘗試將ADSC向神經(jīng)方向誘導(dǎo)分化，他們使用10%FBS DMEM 誘導(dǎo)劑（5μg/mL胰島素+200μM吲哚美辛+0.5mM二甲基亞甲基黃嘌呤）。持續(xù)誘導(dǎo)ADSC 2周，有43%的細(xì)胞分化為神經(jīng)元[6]。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，這種誘導(dǎo)方法不僅費(fèi)時(shí)，而且誘導(dǎo)分化效率不高。本文借鑒了WOODBURY雞尾酒式的分階段誘導(dǎo)方式[7]，而且在預(yù)誘導(dǎo)劑中加入了含較高濃度神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的神經(jīng)祖細(xì)胞維持培養(yǎng)基（NPMM）以減少誘導(dǎo)劑對(duì)分化中細(xì)胞的毒性[8]。本實(shí)驗(yàn)中分化后的細(xì)胞免疫熒光染色僅表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NSE，而不表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，說(shuō)明經(jīng)以上方法誘導(dǎo)后，ADSC大多分化為神經(jīng)元，而不向膠質(zhì)方向分化，這與形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果相符合。我們觀察ADSC分化的過(guò)程中，神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物Nestin表達(dá)率是逐漸下降，所以ADSC的分化徑線與機(jī)制與骨髓干細(xì)胞是有差別的，前者不經(jīng)歷神經(jīng)干細(xì)胞的中間階段，因而分化產(chǎn)物中也沒(méi)有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

ADSC來(lái)源充足，培養(yǎng)方便而且易于向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化，有望成為我們解決中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元難以再生的有利工具。

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