招志毅，彭燕一

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 眼科，廣西 桂林 541001）

眼外傷常常引起玻璃體腔內(nèi)出血，導(dǎo)致增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopathy，PVR）。伴玻璃體出血的眼球穿通傷PVR發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于視網(wǎng)膜脫離手術(shù)后PVR發(fā)生率[1]。目前，治療玻璃體出血的藥物并不理想。蛇毒降纖酶是從尖吻蝮蛇毒液中分離、純化的凝血酶樣酶制劑。藥理上它能降低血漿中纖維蛋白原含量，以及激發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織型溶纖酶原激活物，激活纖溶酶原，水解纖維蛋白，促進(jìn)出血的吸收[2]。曲安奈德是一種長(zhǎng)效糖皮質(zhì)激素，能夠減輕炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞的增生，有減輕PVR形成的作用[3，4]。本實(shí)驗(yàn)觀察了蛇毒降纖酶聯(lián)合曲安奈德在外傷性玻璃體出血的治療效果，并對(duì)其玻璃體腔細(xì)胞因子的變化進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康新西蘭大白兔40只，體重2.25～2.5 kg，雌雄各半，右眼為實(shí)驗(yàn)眼，左眼為空白對(duì)照眼。右眼隨機(jī)分為生理鹽水組（10眼）、蛇毒降纖酶組（10眼）、曲安奈德組（10眼）、聯(lián)合用藥組（10眼）。

1.1.2 主要試劑和儀器 蛇毒降纖酶5u/瓶（廣西醫(yī)科大學(xué)蛇毒研究所提供），曲安奈德40mg/（mL·瓶）（昆明積大制藥有限公司），MMP-9、TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒由美國(guó)Bionewtrans Pharmaciutical公司提供。Clinibio128酶標(biāo)檢測(cè)儀，電子顯微鏡（日本HITACHI H-600型）。

1.2 動(dòng)物模型制作

術(shù)前3 d點(diǎn)用洛美沙星眼液，復(fù)方托品酰胺散瞳，肌肉內(nèi)注射氯胺酮35mg/kg+氯丙嗪5mg/kg，分離上方9～3點(diǎn)的球結(jié)膜，在角膜緣后2mm處用鞏膜穿刺刀刺向玻璃體中心部，勿傷及晶狀體及周邊視網(wǎng)膜，用剪刀向兩側(cè)擴(kuò)大切口，切口與角膜緣平行，達(dá)8mm，輕壓眼球，將脫出的玻璃體剪除，用8-0尼龍線間斷縫合切口。以2mL注射器抽取兔耳動(dòng)脈血1mL，玻璃體腔注入0.3mL全血。用1mL注射器按實(shí)驗(yàn)各組要求把藥物注入玻璃體：生理鹽水組注射生理鹽水0.1mL；蛇毒降纖酶組注射蛇毒降纖酶0.1 u/0.1mL；曲安奈德組注射曲安奈德1.0mg/0.1mL；聯(lián)合用藥組分別注射曲安奈德1.0mg/0.1mL及蛇毒降纖酶0.1 u/0.1mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 玻璃體出血指數(shù)觀察 采用文獻(xiàn)報(bào)道[5]分級(jí)方法。根據(jù)眼底4個(gè)象限可見(jiàn)程度分0～3級(jí)，各象限級(jí)別相加，總和即為指數(shù)。0級(jí)：積血完全吸收，眼底清晰。1級(jí)：玻璃體輕度積血，眼底輕度模糊，但尚能看清。2級(jí)：玻璃體中度積血，眼底很難看清，僅可見(jiàn)模糊結(jié)構(gòu)。3級(jí)：玻璃體重度積血，眼底窺不進(jìn)。手術(shù)后每2天使用直接眼底鏡檢查眼底情況，記錄玻璃體出血指數(shù)。

1.3.2 PVR分級(jí)觀察 采用Fastenberg分級(jí)方法[6]。手術(shù)后每2天使用直接眼底鏡檢查眼底情況，記錄PVR程度。

1.3.3 玻璃體液MMP-9、TGF-β1濃度檢測(cè) 手術(shù)后7、14 d實(shí)驗(yàn)眼抽取0.1mL玻璃體液，ELISA檢測(cè)MMP-9、TGF-β1光密度值。具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。計(jì)算MMP-9、TGF-β1濃度。

1.4 視網(wǎng)膜毒性評(píng)價(jià)

手術(shù)后28 d取離視盤(pán)下方2mm處視網(wǎng)膜行常規(guī)HE染色、醋酸雙氧鈾與枸櫞酸鉛雙重染色后行光學(xué)和電子顯微鏡檢查。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析采用t-test、ANOVA及非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney Test法。

2 結(jié)果

2.1 玻璃體出血指數(shù)觀察

手術(shù)后3 d聯(lián)合用藥組、蛇毒降纖酶組的眼底逐漸清晰，玻璃體塵狀混濁，基本能看到視網(wǎng)膜情況；生理鹽水組、曲安奈德組仍見(jiàn)玻璃體棕色混濁，眼底窺不清。見(jiàn)表1。

表1 手術(shù)后3 d玻璃體出血指數(shù)（±s）

表1 手術(shù)后3 d玻璃體出血指數(shù)（±s）

注：?表示與生理鹽水組比較

組別 眼數(shù) 指數(shù) P（Mann-Whitney Test）生理鹽水組 10 9.5±0.6 -蛇毒降纖酶組 10 6.5±0.7 P＜0.01?曲安奈德組 10 9.0±0.8P＞0.05?聯(lián)合用藥組 10 6.8±0.4P＜0.01?

2.2 PVR分級(jí)觀察

手術(shù)后28d聯(lián)合用藥組PVR程度低于生理鹽水組，兩組 PVR 程度比較：P=0.0013＜0.01（Mann-Whitney test）。聯(lián)合用藥組PVR程度與蛇毒降纖酶組、曲安奈德組未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別為P=0.4359＞0.05；P=0.3742＞0.05；（Mann-Whitney test）。見(jiàn)表2。

表2 手術(shù)后28 d PVR分級(jí)（例數(shù)）

術(shù)后28 d聯(lián)合用藥組4眼（40%）發(fā)生視網(wǎng)膜脫離，比生理鹽水組（100%）、蛇毒降纖酶組（50%）及曲安奈德組（60%）低。

2.3 玻璃體腔中MMP-9檢測(cè)

手術(shù)后7d、14d聯(lián)合用藥組玻璃體液MMP-9濃度比生理鹽水組低（分別為t值：3.512、P值=0.0025＜0.01；t值：6.7545、P值=0.0005＜0.01；t-test）；與曲安奈德組、蛇毒降纖酶組相比未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為7d t值：2.0068、P值=0.06＞0.05；t值：0.1574、P值=0.8767＞0.05；14 d t值：1.4024、P ＞0.05；t值：1.299、P值=0.2351＞0.05；t-test）。見(jiàn)表3。

表3 玻璃體液MMP-9濃度的比較（pg/mL，±s）

表3 玻璃體液MMP-9濃度的比較（pg/mL，±s）

注：1）各組間玻璃體液 MMP-9 含量比較，P=0.024＜0.05；2）P=0.017＜0.05；（Kruskal-wallis ANOVA）

組別生理鹽水組蛇毒降纖酶組曲安奈德組聯(lián)合用藥組7d1） 14d2）343.75±57.19 384.64±33.22 231.56±39.48 283.39±44.44 321.52±109.71 313.57±85.56 235.93±78.45 251.79±21.07

2.4 玻璃體腔中TGF-β1檢測(cè)

手術(shù)后7 d、14 d聯(lián)合用藥組玻璃體液TGF-β1濃度比生理鹽水組低（分別為t值：2.8445、P值=0.0108＜0.05；t值：3.2426、P值=0.0176＜0.05；t-test；）。與蛇毒降纖酶組、曲安奈德組相比未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為7d t值：0.3315、P值=0.7441＞0.05；t值：0.4282、P值=0.6736＞0.05；14 d t值：1.3245、P值=0.2269＞0.05；t值：1.052、P值=0.087＞0.05；t-test）。見(jiàn)表4。

表4 玻璃體液TGF-β1濃度的比較（pg/mL，±s）

表4 玻璃體液TGF-β1濃度的比較（pg/mL，±s）

注：1）各組間玻璃體液 TGF-β1 含量比較，P=0.036＜0.05；2）P=0.025＜0.05；（Kruskal-wallis ANOVA）

組別生理鹽水組蛇毒降纖酶組曲安奈德組聯(lián)合用藥組7d1） 14d2）102±35.47 123.18±34.34 65.58±25.52 80.65±21.04 56.67±24.47 51.41±13.13 61.65±27.46 65.53±9.23

2.5 視網(wǎng)膜毒性評(píng)價(jià)

視網(wǎng)膜光鏡檢查見(jiàn)聯(lián)合用藥組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)整齊；電鏡檢查視網(wǎng)膜內(nèi)外節(jié)排列整齊。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)嘗試玻璃體腔聯(lián)合應(yīng)用促進(jìn)出血吸收的藥物蛇毒降纖酶和抗炎藥物曲安奈德治療實(shí)驗(yàn)性外傷性玻璃體出血，觀察其對(duì)治療玻璃體出血及防治PVR的效果。蛇毒降纖酶是從蛇毒提取經(jīng)生物技術(shù)純化精制的一種強(qiáng)效凝血酶樣酶，可直接作用于血漿纖維蛋白原的肽鏈A，形成脫肽鏈A纖維蛋白可溶性單體而被溶纖酶迅速消溶；另外，蛇毒降纖酶還能激發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織溶纖酶原激活物促進(jìn)出血的吸收[2]。曲安奈德是一種長(zhǎng)效糖皮質(zhì)激素，具有很強(qiáng)的抗炎作用，可降低炎癥血管的滲透性、減少血-視網(wǎng)膜屏障的破壞。有學(xué)者報(bào)道，玻璃體腔應(yīng)用曲安奈德可以減輕PVR形成的程度[3，4]。在本實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合用藥組玻璃體出血指數(shù)、PVR程度明顯比生理鹽水組低，說(shuō)明蛇毒降纖酶和曲安奈德能明顯促進(jìn)玻璃體腔出血的吸收，以及降低PVR的發(fā)展程度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)各組視網(wǎng)膜脫離率的比較，我們發(fā)現(xiàn)玻璃體腔聯(lián)合用藥組較單一用藥更能降低視網(wǎng)膜脫離率的發(fā)生。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組玻璃體液MMP-9、TGF-β1濃度比生理鹽水組低。目前認(rèn)為，細(xì)胞因子對(duì)增殖細(xì)胞遷移、增生的調(diào)控起著重要的作用。MMP-9是一種含有鋅指結(jié)構(gòu)的中性蛋白酶，可由視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌，具有降解變性膠原分子及天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型天然膠原的活性，并參與了炎癥反應(yīng)和傷口愈合過(guò)程[7，8]。有學(xué)者認(rèn)為，其與纖維增生性PVR形成有關(guān)[9～11]。TGF-β1是一種多功能、高度雙向的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞遷移和增殖卻抑制上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖，血小板是其最主要的來(lái)源，但玻璃體腔中RPE細(xì)胞及巨噬細(xì)胞也能分泌并釋放TGF-β1。有文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β1始終參與 PVR 的發(fā)生及發(fā)展[12，13]。聯(lián)合用藥組通過(guò)曲安奈德抗炎作用，使向玻璃體腔遷移的RPE細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血小板較生理鹽水組減少；通過(guò)蛇毒降纖酶促進(jìn)出血吸收的作用，減輕了玻璃體出血引起的、以巨噬細(xì)胞為主的慢性玻璃體炎癥。因此，我們推測(cè)這可能是聯(lián)合用藥組玻璃體腔的MMP-9、TGF-β1濃度較生理鹽水低的原因。相反，玻璃體腔MMP-9、TGF-β1濃度的降低反過(guò)來(lái)又抑制增殖細(xì)胞遷移、增生以及細(xì)胞外基質(zhì)的形成。我們推想，這可能是聯(lián)合用藥組PVR程度低于生理鹽水組、視網(wǎng)膜脫離率低于各組的原因。

在本實(shí)驗(yàn)中，聯(lián)合用藥組玻璃體液MMP-9、TGF-β1濃度與蛇毒降纖酶組、曲安奈德組相比未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這是否是聯(lián)合用藥組PVR程度與曲安奈德組、蛇毒降纖酶組相比下降不明顯的原因之一，還待進(jìn)一步研究。最后，通過(guò)視網(wǎng)膜光鏡、電鏡檢查，未見(jiàn)聯(lián)合用藥對(duì)視網(wǎng)膜有毒性作用。

綜上所述，玻璃體腔曲安奈德和蛇毒降纖酶聯(lián)合應(yīng)用可以促進(jìn)玻璃體腔出血的吸收、降低外傷性PVR程度；同時(shí)，下調(diào)玻璃體腔MMP-9、TGF-β1濃度。與單獨(dú)應(yīng)用曲安奈德、蛇毒降纖酶相比，玻璃體腔聯(lián)合用藥更能降低視網(wǎng)膜脫離率的發(fā)生，但PVR下降程度與單一藥物組相比未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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