曹蘭琴，黎 欣，劉惠寧，易 紅，李 岑

（中南大學湘雅醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410008）

人絨毛膜癌（絨癌）為惡性滋養(yǎng)葉細胞腫瘤，是發(fā)生于生育年齡婦女的常見腫瘤。臨床上以化療為治療絨癌的主要方法，化療對這一惡性程度很高、病情兇險的婦科腫瘤可以取得根治性的效果[1]?，F(xiàn)有的資料表明，低危絨癌的治愈率可達100%，高危絨癌的生存率也可達85%以上[2]。但是，近年來隨著難治性特別是耐藥患者的增多，常常導致化療失敗[3]。難治性絨癌的治療很棘手，既要尋找難治的發(fā)生機制，又要不斷尋找新藥和新的化療方案來改善患者的預后。紫杉醇作為新一代植物堿類抗腫瘤藥物，現(xiàn)已作為卵巢癌的一線化療藥物，該藥對絨癌是否也有效有待于研究。本實驗通過檢測紫杉醇對絨癌細胞增殖及凋亡的影響，為臨床上應用紫杉醇來治療難治性絨癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

①細胞株：人絨毛膜癌細胞系JEG-3購自北京中國科學院動物研究所計劃生育及生殖生物學國家重點實驗室。②主要試劑：紫杉醇（多西他賽）系江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；PRMI1640、胰酶、EDTA、DMSO均為美國Gibco產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍（MTT）為美國Sigma公司產(chǎn)品；D-Hanks液、雙抗小牛血清均由湘雅醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將JEG-3細胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)液內(nèi)，置于37℃、飽和濕度、含5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1～2 d更換培養(yǎng)液一次或根據(jù)培養(yǎng)液的顏色換液。待細胞長滿瓶底70%～80%后，胰酶消化傳代。取生長狀態(tài)穩(wěn)定，對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 實驗分組 實驗中將細胞分成兩組。對照組：只加RPMI1640培養(yǎng)液；加藥組：加入含紫杉醇濃度分別為：0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL及100μg/mL的RPMI1640培養(yǎng)液。

1.2.3 MTT實驗 將JEG-3細胞按5×104個/孔密度接種于96孔培養(yǎng)板上，24h吸出原培養(yǎng)液，加藥組加入含紫杉醇濃度分別為 0.001、0.01、0.1、1、10及100μg/mL的RPMI1640培養(yǎng)液200μL，設培養(yǎng)液中不加藥物（加相同濃度的DMSO）為對照組，另設空白對照。每組設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入MTT溶液20μL，培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。小心吸出各孔內(nèi)的培養(yǎng)基及藥物溶液，每孔加入DMSO液150μL溶解，振蕩10min，于酶標儀上以測定波長為630 nm，參考波長為490 nm，測定其吸光度（A）。48 h及72 h后，同法處理96孔板。根據(jù)下面公式計算出抑制率并繪制抑制率曲線，細胞生長增殖抑制率（%）=（1-給藥組細胞A值/對照組細胞A值）×100%。以上實驗重復三次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期0.001μg/mL、0.01μg/mL及 0.1μg/mL三種濃度紫杉醇作用于JEG-3細胞24 h和48 h收集細胞，制成1×106/mL細胞懸液，用PBS溶液洗兩遍，加入預冷的70%乙醇固定，送檢。測定前用PBS洗去乙醇，加入PI染液，避光染色30min后，流式細胞儀進行細胞凋亡和細胞周期的檢測。細胞凋亡和細胞周期的檢測各重復三次。

1.3 統(tǒng)計學處理

本實驗數(shù)據(jù)資料采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 紫杉醇對JEG-3細胞增殖的影響

分別用終濃度為 0.001、0.01、0.1、1、10 及100μg/mL的紫杉醇處理JEG-3細胞24、48和72 h，同一濃度紫杉醇作用下，隨著作用時間的延長，細胞增殖抑制率增加，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。細胞增殖抑制率與作用時間具有直線相關線，相關系數(shù)r均＞0.8，P＜0.05；同一時間作用下，隨著紫杉醇濃度的增加，細胞增殖抑制率增加，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。細胞增殖抑制率與紫杉醇濃度具有直線相關性，相關系數(shù) r均 ＞0.8，P＜0.05。紫杉醇作用 24、48及72 h的 IC50分別為 99.8μg/mL，3.1μg/mL，0.1μg/mL。詳見表1及圖1。

表1 不同濃度紫杉醇作用24、48、72h后的JEG-3細胞增殖抑制率（%，n=3，±s）

表1 不同濃度紫杉醇作用24、48、72h后的JEG-3細胞增殖抑制率（%，n=3，±s）

注：按α=0.05水準，同一濃度不同時間組與對照組增殖抑制率比較，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義；同一時間不同濃度組與對照組增殖抑制率比較，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義

紫杉醇濃度（μg/mL）0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.001 11.33±0.27 13.71±0.21 20.11±0.15 0.01 15.37±0.42 26.19±0.74 33.66±0.26 0.1 18.61±0.34 34.03±0.52 50.33±0.43 1 30.83±0.55 44.99±0.37 66.22±0.51 10 39.81±0.47 60.27±0.28 79.53±0.38 100 50.41±0.62 87.67±0.46 97.12±0.22作用時間24 h 48 h 72 h 0

圖1 紫杉醇不同濃度-時間增殖抑制率曲線圖

表2 不同濃度紫杉醇作用24、48h后的JEG-3細胞凋亡率（%，n=3，±s）

表2 不同濃度紫杉醇作用24、48h后的JEG-3細胞凋亡率（%，n=3，±s）

注：按α=0.05水準，同一濃度不同時間組與對照組凋亡率比較，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義；不同時間組間比較，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義；同一時間不同濃度組與對照組凋亡率比較，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義；不同濃度組間兩兩比較，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義

紫杉醇濃度（μg/mL） 作用時間24 h 48 h01.25±0.24 1.34±0.37 0.001 10.22±0.32 12.68±0.49 0.01 14.55±0.26 23.96±0.57 0.1 16.93±0.45 32.03±0.39

2.2 流式細胞儀檢測JEG-3細胞凋亡率和細胞周期

2.2.1 細胞凋亡率 分別用終濃度為0.001、0.01及0.1μg/mL的紫杉醇處理JEG-3細胞24 h和48 h，隨著紫杉醇作用濃度的增加和藥物作用時間的延長，細胞凋亡率逐漸增大。各組比較差異均有顯著性，見表2及圖 2、3。

圖2 不同濃度紫杉醇作用24h后JEG-3細胞凋亡圖

圖3 不同濃度紫杉醇作用48h后JEG-3細胞凋亡圖

2.2.2 細胞周期分析 分別用終濃度為0.001、0.01及0.1μg/mL的紫杉醇處理JEG-3細胞24 h和48 h，同一時間，隨著紫杉醇濃度的增加，G2/M期細胞百分比增加，P＜0.05，有統(tǒng)計學意義，見表3及圖4、5。

表3 不同濃度紫杉醇處理JEG-3細胞24和48h后的細胞周期百分比（%，n=3，±s）

表3 不同濃度紫杉醇處理JEG-3細胞24和48h后的細胞周期百分比（%，n=3，±s）

注：按α=0.05水準，同一時間不同濃度組G2/M期細胞百分比均大于對照組，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義。?為實驗誤差

作用時間 G0/G1SG2/M 24 h空白對照組 40.7±1.7 43.7±0.9 15.6±1.1紫杉醇組0.001μg/mL 10.1±2.3 40.6±1.4 49.2±1.2 0.01μg/mL 6.1±1.7 42.6±2.1 51.2±0.6 0.1μg/mL 6.1±0.8 28.4±1.6 65.5±1.3 48 h空白對照組 35.2±1.2 53.2±0.9 11.6±1.4紫杉醇組0.001μg/mL 12.9±1.9 34.9±1.6 52.2±2.0 0.01μg/mL 12.0±0.9 25.6±2.2 62.4±3.6 0.1μg/mL 7.4±1.4 30.3±1.5 62.3±2.2?

3 討論

自發(fā)現(xiàn)一系列有效化療藥物后，絨癌的治愈率明顯提高，使其成為能單用化療得以治愈的實體腫瘤之一。絨癌常用的化療藥物是氟尿嘧啶、更生霉素及氨甲喋呤等。然而，有部分絨癌患者對這些常用的化療藥物不敏感，治療后病情仍進展，需改用二線或三線化療[4]。為解決這一棘手的臨床問題，尋找有效的化療藥及其它有效治療方法如手術等具有重要的臨床意義[5]。

紫杉醇是一種細胞周期特異性抗腫瘤藥物，它作用的主要靶點是微管系統(tǒng)，它能促進微管聚合，抑制微管降解，使細胞分裂阻滯在G2/M期，最終導致細胞死亡，紫杉醇對G2/M期的阻滯作用是誘導細胞凋亡的重要機制[6]。由于紫杉醇誘導細胞凋亡的作用，故對多種惡性腫瘤具有顯著的療效。紫杉醇在卵巢癌的治療中已積累了大量的臨床經(jīng)驗，目前已成為卵巢癌化療的一線藥物。紫杉醇在滋養(yǎng)細胞腫瘤的臨床應用報道較少，對耐藥性滋養(yǎng)細胞腫瘤的治療雖然也有成功的報道，但多為個案或少數(shù)病例，其確切療效尚有待進一步臨床驗證。JONES等[7]在2例對EMA-co和DDP耐藥的絨癌治療中，使用紫杉醇或結合卡鉑均有效。體外實驗證實，紫杉醇能誘導人絨癌JAR細胞的凋亡[8]。王華斌等[9]研究了紫杉醇、順鉑對絨癌更生霉素耐藥細胞株和非耐藥細胞株的抑制作用，結果發(fā)現(xiàn)兩種細胞株對紫杉醇和順鉑均具有敏感性。

圖4 不同濃度紫杉醇作用24h后JEG-3細胞周期圖

圖5 不同濃度紫杉醇作用48h后JEG-3細胞周期圖

本研究通過MTT法測定了紫杉醇對絨癌細胞生長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)隨著紫杉醇濃度的加大和作用時間的延長，細胞存活率逐漸下降，表明紫杉醇對絨癌細胞的殺滅作用呈時間和劑量依賴關系。通過計算發(fā)現(xiàn)紫杉醇作用于絨癌細胞72 h的IC50為0.1μg/mL，和目前臨床上對紫杉醇敏感腫瘤的IC50值基本相當[10]。

紫杉醇是細胞阻斷劑，能夠誘導多種癌細胞的凋亡，它的抗癌效果與其誘導細胞凋亡的能力密切相關。本實驗通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度紫杉醇作用24 h和48 h后，各紫杉醇作用組細胞凋亡率均大于對照組，且隨著紫杉醇濃度的增加，細胞凋亡率增加；同一濃度紫杉醇作用下，隨著作用時間的延長，細胞凋亡率也增加。

G2/M期是細胞周期的兩個重要檢查點之一，是細胞增殖的重要階段。多種DNA損傷劑（射線、化學藥物等）均可引起G2/M`期阻滯，由于G2/M期阻滯在抑制細胞增殖和促進細胞凋亡中的作用，因此G2/M期阻滯與抑制多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。余志英等[11]在研究紫杉醇誘導卵巢癌細胞凋亡及細胞周期改變時發(fā)現(xiàn)，隨著藥物作用時間的延長，G2/M期阻滯逐漸明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇作用于絨癌細胞后隨著藥物濃度的增加，G2/M期細胞的百分比明顯增加。但DZIADYK等[12]認為，紫杉醇誘導的凋亡和G2/M期細胞阻滯無關，而是通過NF-KB/IKB途徑誘導腫瘤細胞凋亡的。本實驗的結果不支持此觀點，傾向于認為紫杉醇通過將絨癌細胞周期阻滯在G2/M期，從而誘導絨癌細胞的凋亡。

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