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        脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力的研究

        2010-11-03 06:28:16李寶軍鄧展生高嵩濤郭曉檸張勝利沈民仁
        關(guān)鍵詞:充質(zhì)高密度軟骨

        李寶軍 ,鄧展生 ,高嵩濤 ,郭曉檸 ,張勝利 ,沈民仁

        (1.湖南省第二人民醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)外科,湖南 長(zhǎng)沙 410007;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 脊柱外科,湖南 長(zhǎng)沙410008;3.河南省腫瘤醫(yī)院 骨科,河南 鄭州 450008)

        關(guān)節(jié)軟骨的自我修復(fù)能力十分有限,臨床上由于創(chuàng)傷、腫瘤、感染以及退行性變等原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)軟骨損傷和缺損尚無(wú)理想的修復(fù)方法[1],為矯形關(guān)節(jié)外科亟需解決的難題。組織工程學(xué)的興起和不斷發(fā)展,為利用組織工程化軟骨進(jìn)行軟骨缺損修復(fù)帶來(lái)了希望。目前,有關(guān)軟骨組織工程種子細(xì)胞的研究以軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為主,隨著組織工程學(xué)研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)脂肪組織也是多能干細(xì)胞的來(lái)源之一,而脂肪干細(xì)胞(ADSC)和骨髓干細(xì)胞(BMSC)一樣,具有多向分化潛能[2],且相對(duì)于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有來(lái)源廣泛、易于獲得、對(duì)機(jī)體影響小、并且可獲得大量細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠作為研究對(duì)象,探討了脂肪干細(xì)胞體外提取并定向分化為軟骨細(xì)胞的能力。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        正常成年健康SD大鼠,雌雄不限,質(zhì)量80~120 g(由中南大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)部提供,許可證號(hào):滬SCXK2003-0003)。新生牛血清、低糖DMEM、高糖DMEM(Gibco,American);TGF-β1(Cellcience,Australia);胰島素,轉(zhuǎn)鐵蛋白,地塞米松和維生素C、胰酶、膠原酶 I型(Sigma,American);抗 II型膠原多克隆山羊抗體(Cellcience,Australia),生物素化抗山羊IGg和DAB顯色試劑盒(北京中山金橋公司);aggrecan兔抗大鼠多克隆抗體(Santa Cruz,Australia),辣根酶標(biāo)記抗兔IGg和FITC標(biāo)記抗兔IGg(北京中山金橋公司);組織細(xì)胞總RNA提取試劑Trizol(MRC,American)、RT反應(yīng)試劑盒、PCR 反應(yīng)試劑盒(MBI,American)。

        1.2 方法

        1.2.1 ADSC的分離、培養(yǎng) SD大鼠(80~120 g),斷頸處死;75%的酒精浸泡5min;無(wú)菌條件下取雙側(cè)腹股溝脂肪,PBS充分沖洗,剪碎至1mm3大小碎塊;予0.075%I型膠原酶在37℃振蕩消化40~50 min;等量的含10%新生牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化,于200目濾網(wǎng)過(guò)濾以去除大塊未消化脂肪組織,1 300 r/min離心10min,去上清;PBS重懸細(xì)胞洗滌,200目濾網(wǎng)再過(guò)濾,1 300 r/min離心10 min,去上清;含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含青霉素100μ/mL,鏈霉素100μg/mL)重懸細(xì)胞,取樣行臺(tái)盼藍(lán)染色拒染,計(jì)算細(xì)胞數(shù)量和活力,以106/100mm2培養(yǎng)板底面積種植活力細(xì)胞,在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下培養(yǎng)。經(jīng)2~3d換液1次,細(xì)胞增殖、鋪滿至培養(yǎng)瓶底約80%,接近融合狀態(tài)時(shí),予0.25%胰酶消化傳代。

        1.2.2 ADSC的成軟骨誘導(dǎo) 收集傳5代ADSC,含10%新生牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整密度為1.5×107/mL,予10μL/滴在24孔培養(yǎng)板內(nèi)。進(jìn)行“微團(tuán)”培養(yǎng)后1 d,換用含1%新生牛血清、10 ng/mL的 TGF-β1、6.25μg/mL的胰島素、6.25μg/mL的轉(zhuǎn)鐵蛋白、10-7M的地塞米松、50 μg/mL的維生素C的高糖DMEM作為特定培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

        1.2.3 免疫組化染色和免疫熒光 在誘導(dǎo)7、14 d后,取細(xì)胞玻片經(jīng)4%多聚甲醛固定,應(yīng)用II型膠原蛋白免疫組化染色和aggrecan免疫熒光檢測(cè)。①II型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色:細(xì)胞玻片依次經(jīng)3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶15 min,PBS沖洗,10%正常兔血清封閉非特異性結(jié)合30 min,滴加1∶100的抗II型膠原多克隆山羊抗體濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜,PBS沖洗,滴加1∶100生物素標(biāo)記的抗山羊IGg孵育15min,PBS沖洗,辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素孵育15min,PBS沖洗,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。②Aggrecan細(xì)胞免疫熒光:細(xì)胞玻片依次經(jīng)3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶15min,PBS沖洗,10%正常山羊血清封閉,室溫孵育10~15min,傾去血清,勿洗,滴加1∶100稀釋的aggrecan兔抗大鼠多克隆一抗,4℃孵育過(guò)夜,PBS沖洗,滴加1:100稀釋的FITC標(biāo)記抗兔Ig G二抗,37℃孵育30~60min,PBS沖洗,熒光顯微鏡下觀察、拍照記錄,50%甘油封片保存。

        1.2.4 RT-PCR檢測(cè) 在誘導(dǎo) 0、2和 4周后,RT-PCR檢測(cè)ADSC前II型膠原蛋白、aggrecan和Sox9的mRNA基因表達(dá)情況。分別采用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA,RT試劑盒合成cDNA。采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物,并經(jīng)GeneBank驗(yàn)證。引物序列為:β-actin(上游5'-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3',下游 5'-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3’;201 bp);Col2a1(上游 5'-CAAGTCGCTGAACAACCAGA-3',下游 5'-GCCCTCATCTCCACATCATT-3’;320 bp);Agc1(上游 5'-TAGAGAAGAAGAGGGGTTAGG-3',下游 5'-AGCAGTAGGAGCCAGGGTTAT-3';322 bp);Sox9(上游 5'-CGGAACAGACTCACATCTCTCCTAATGC-3’,下游 5’-CGAAGGTCTCAATGTTGGAGATGACGTC-3’;292 bp)。根據(jù)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增合成DNA,反應(yīng)條件:Col2a1(預(yù)變性 94℃5s;變性 94℃ 45 s,退火56℃ 45 s,延伸72℃ 50 s,循環(huán)30次;再延伸72℃7 min);Agc1(預(yù)變性 94℃5min;變性 94℃ 45 s,退火 54℃ 45 s,延伸72℃ 1min,循環(huán) 28次;再延伸 72℃ 7min);Sox9(預(yù)變性 94℃5min;變性94℃ 45 s,退火 54℃ 45 s,延伸 72℃1min,循環(huán)32次;再延伸72℃ 7min)。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行鑒定。

        2 結(jié)果

        2.1 ADSC誘導(dǎo)后形態(tài)特征

        5代ADSC形態(tài)均一,呈長(zhǎng)梭形,接近融合狀態(tài)時(shí)可呈漩渦樣生長(zhǎng),細(xì)胞之間可見(jiàn)零星脂滴存在(圖1)。誘導(dǎo)2 d后,細(xì)胞形態(tài)由梭型漸變?yōu)槿切?、多角形、短梭形,?xì)胞增殖明顯減緩,呈聚集生長(zhǎng),基質(zhì)分泌,形成有結(jié)節(jié)(圖2)。10 d左右結(jié)節(jié)呈類軟骨樣外觀,不再增大。

        圖1 第5代ADSC(×100)

        圖2 第5代ADSC(×100)誘導(dǎo)后48 h

        2.2 ADSC誘導(dǎo)后免疫組化染色和免疫熒光

        ADSC誘導(dǎo)7 d后,聚集結(jié)節(jié)Ⅱ型膠原免疫組化染色見(jiàn)胞膜、胞外基質(zhì)呈棕黃色異染陽(yáng)性(圖3);14d后聚集形成的結(jié)節(jié)呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),可在小結(jié)節(jié)看到均勻密布的胞膜胞外基質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)(圖4);未誘導(dǎo)組細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色陰性。

        ADSC誘導(dǎo)后7 d的aggrecan細(xì)胞免疫熒光檢測(cè),可見(jiàn)其胞漿、胞膜和胞外基質(zhì)有綠色熒光表達(dá),尤以聚集結(jié)節(jié)表達(dá)明顯(圖5);14 d后可見(jiàn)高密度細(xì)胞層面和周邊的網(wǎng)狀物呈綠色熒光表達(dá)(圖6);未誘導(dǎo)組細(xì)胞則未見(jiàn)明確綠色熒光表達(dá)。

        圖3 ADSC誘導(dǎo)7 dⅡ型膠原染色(×600)

        圖4 ADSC誘導(dǎo)14 dⅡ型膠原染色(×600)

        圖5 ADSC誘導(dǎo)7daggrecan熒光(×600)

        圖6 ADSC誘導(dǎo)14 d aggrecan熒光(×600)

        2.3 RT-PCR檢測(cè)ADSC誘導(dǎo)后Col2al、Agc1和Sox9的m RNA的表達(dá)情況

        對(duì)微團(tuán)培養(yǎng)的ADSC在誘導(dǎo)0周(即未誘導(dǎo))、2周和4周,采用RT-PCR從基因水平檢測(cè)其Col2al、Agc1和Sox9的mRNA表達(dá)情況,可見(jiàn)總RNA表達(dá)完整(圖7),內(nèi)參照β-actin均在201 bp條帶表達(dá);在未誘導(dǎo)組,未見(jiàn) Col2al、Agc1和Sox9的mRNA表達(dá)條帶出現(xiàn)。在誘導(dǎo)2、4周組均可見(jiàn):Col2al的mRNA在320 bp條帶表達(dá);Agc1的mRNA在322 bp條帶表達(dá);Sox9的mRNA在292 bp條帶表達(dá)(圖 8,9,10)。比較誘導(dǎo)后 2,4周2組目的條帶和內(nèi)參灰度值之比,應(yīng)用兩樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較,顯示誘導(dǎo)后 2,4周時(shí)間點(diǎn) Col2al、Agc1和Sox9的mRNA表達(dá)水平,P值均>0.05,無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(附表)。

        附表脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后2,4周Col2al、Agc1和Sox9的mRNA表達(dá)水平(±s)

        附表脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后2,4周Col2al、Agc1和Sox9的mRNA表達(dá)水平(±s)

        誘導(dǎo)后時(shí)間點(diǎn)樣本數(shù)n Sox9/β-actin mRNA灰度值比2周5 0.737±0.033 0.766±0.027 0.781±0.022 4周5 0.745±0.037 0.788±0.015 0.796±0.021 Col2al/β-actin mRNA灰度值比Agc1/β-actin mRNA灰度值比

        圖7 高密度ADSC誘導(dǎo)后總RNA表達(dá)

        圖8 高密度ADSC誘導(dǎo)后Col2al的mRNA表達(dá)電泳

        圖9 高密度ADSC誘導(dǎo)后Acg1的mRNA的表達(dá)電泳

        圖10 高密度ADSC誘導(dǎo)后Sox9的m RNA的表達(dá)電泳

        3 討論

        關(guān)節(jié)軟骨損傷和退行性疾病依然是全球范圍內(nèi)威脅健康的主要問(wèn)題之一。盡管在手術(shù)或非手術(shù)措施進(jìn)行干預(yù)治療方面進(jìn)展很快,但軟骨損傷的修復(fù)仍然是十分棘手的問(wèn)題[4]。軟骨組織工程結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)、工程學(xué)、材料科學(xué)和外科學(xué),旨在重建新的有功能組織,為關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)奠定基礎(chǔ),以期能夠獲得最終長(zhǎng)期的功能恢復(fù),成為解決軟骨修復(fù)難題最有前景的一種途徑[5]。有關(guān)軟骨組織工程種子細(xì)胞的研究多數(shù)集中于軟骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,而有關(guān)ADSC作為軟骨組織工程種子細(xì)胞的研究相對(duì)少見(jiàn)[3]。既往研究表明,在體外特定的培養(yǎng)基條件下,ADSC可以表達(dá)成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞表型,因而可能會(huì)成為穩(wěn)定可靠的種子細(xì)胞[6]。

        胚胎時(shí)期,軟骨的形成是通過(guò)中胚層間充質(zhì)細(xì)胞之間以及細(xì)胞基質(zhì)之間的相互作用的調(diào)節(jié)而形成的細(xì)胞濃縮相來(lái)完成的[7]。本試驗(yàn)采取微團(tuán)培養(yǎng)的方式進(jìn)行成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo),這種高密度的接種近似于三維培養(yǎng),有利于細(xì)胞之間的相互黏附和信號(hào)傳遞[7],部分地模擬了胚胎時(shí)期的高密度細(xì)胞聚集生成軟骨的現(xiàn)象[8]。BARRY[9]等認(rèn)為,間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨的條件包括:①三維培養(yǎng)方式;②無(wú)血清誘導(dǎo)劑;③加入TGF-β超家族生長(zhǎng)因子。血清中包含有許多不確定的生長(zhǎng)因子和分化因子,進(jìn)而可能激發(fā)干細(xì)胞的自發(fā)多向分化潛能,而不是向軟骨方向的單向分化。因此,促進(jìn)干細(xì)胞向軟骨分化的理想培養(yǎng)環(huán)境,應(yīng)該限定于化學(xué)組成和無(wú)血清或合成血清代用品,如果有必要,可以配備特定的重組細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子[10]。然而,目前尚無(wú)十分理想的無(wú)血清培養(yǎng)基或誘導(dǎo)劑能夠同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞的分化和增殖,而且對(duì)配備的細(xì)胞生長(zhǎng)因子要求高,費(fèi)用昂貴。參考國(guó)外ZUK[6]等有關(guān)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的培養(yǎng)基條件,本實(shí)驗(yàn)中采用含1%新生牛血清誘導(dǎo)劑。

        在軟骨形成過(guò)程中,TGF-β1是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵因子。高密度的間充質(zhì)干細(xì)胞的聚集是使其定向軟骨細(xì)胞分化的始動(dòng)步驟,而TGF-β1則起著關(guān)鍵的啟動(dòng)作用[11]。這種始動(dòng)作用有可能是其通過(guò)促使軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox9的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞聚集的發(fā)生[11]。胰島素在體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中,對(duì)于維持細(xì)胞的活力,促進(jìn)有絲分裂、糖原和脂肪酸的合成起著十分重要的作用。有研究表明,胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒能夠促進(jìn)人的軟骨細(xì)胞增殖,并減少軟骨細(xì)胞的去分化[12]。地塞米松可以激活間充質(zhì)干細(xì)胞上的糖皮質(zhì)激素受體,促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化,并抑制其向脂肪細(xì)胞的分化。維生素C作為一種輔助的培養(yǎng)基試劑,對(duì)于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨分化過(guò)程中膠原蛋白和蛋白聚糖的合成也有著一定的促進(jìn)作用。在本實(shí)驗(yàn)特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下,ADSC逐漸由長(zhǎng)梭形變化為三角形,多角形和短梭形,表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞形態(tài)特征。誘導(dǎo)后ADSC增殖遲緩,分析原因可能是:首先,細(xì)胞的增殖能力和分化程度是一對(duì)矛盾,增殖能力高的細(xì)胞必然分化程度低,而分化程度高的細(xì)胞必然增殖能力低。在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的過(guò)程中,實(shí)際是向一種高度分化的細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)變,其間必然也伴有增殖能力的降低;其次,并非所有的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在這種特定的培養(yǎng)誘導(dǎo)劑都能夠向軟骨方向分化,不能適合這種誘導(dǎo)環(huán)境的細(xì)胞就可能出現(xiàn)凋亡。Ⅱ型膠原蛋白和aggrecan是軟骨細(xì)胞最特異的表面標(biāo)志,因而是檢測(cè)軟骨細(xì)胞分化形成的最重要指標(biāo)。通過(guò)比較ADSC組和誘導(dǎo)組的不同時(shí)間點(diǎn)的Ⅱ型膠原蛋白免疫組化染色和aggrecan熒光檢測(cè),發(fā)現(xiàn)ADSC的表型確實(shí)發(fā)生著明顯的變化,表現(xiàn)有軟骨細(xì)胞的明顯特征。誘導(dǎo)后的ADSC聚集成結(jié)節(jié)的同時(shí),免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在高密度的ADSC之間有Ⅱ型膠原蛋白和aggrecan表達(dá),隨后的1周和2周后,這種表達(dá)緩慢增強(qiáng),在胞膜、胞漿和細(xì)胞之間強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。應(yīng)用RT-PCR技術(shù),本文進(jìn)一步從基因水平探討了體外ADSC誘導(dǎo)成軟骨過(guò)程中Sox9、Agc1和Col2al的mRNA表達(dá),發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)后2周、4周,Sox9、Agc1和Col2al的mRNA均有穩(wěn)定地高表達(dá),而在未誘導(dǎo)組(即誘導(dǎo)0周時(shí))并沒(méi)有Sox9、Agc1和Col2al mRNA的表達(dá)。該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明,在特定培養(yǎng)基條件下,高密度微團(tuán)培養(yǎng)的ADSC可以定向軟骨細(xì)胞方向分化,并能夠穩(wěn)定表達(dá)軟骨細(xì)胞特異表型,為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程化軟骨奠定了基礎(chǔ)。不斷優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件,解決ADSC分化和增殖受限的矛盾,仍然是以后研究的重點(diǎn)。

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