張立營(yíng)，趙懷龍，馬鳳龍，傅興倫，孫英姿，高 波

相思子毒素是從豆科藤本植物相思子（Abrus precatorius）的種子中提取的一種劇毒性高分子蛋白毒素，其含量約占種子2.8%～3.0%。小鼠的LD50為0.04 μg/kg，成年人攝入的致死劑量為 5.0～7.0 μg/kg，其毒性強(qiáng)度是蓖麻毒素（小鼠LD503.0 μg/kg）的70多倍，已被列為潛在的重要毒素戰(zhàn)劑和生物恐怖病原物質(zhì)之一[1-4]。

國(guó)外已有報(bào)道恐怖分子用相思子毒素作為恐怖襲擊的手段。美國(guó)陸軍醫(yī)學(xué)研究發(fā)展總部早在1991年對(duì)相思子毒素單克隆抗體進(jìn)行研究和應(yīng)用，而國(guó)內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道[5-8]。因此，無(wú)論是從國(guó)際生物武器核查角度，還是從防護(hù)目的，開(kāi)展對(duì)相思子毒素的檢測(cè)研究都具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用相思子毒素毒蛋白免疫BALB/c小鼠制備了相思子毒素單克隆抗體，并對(duì)其進(jìn)行了鑒定。擬為發(fā)展高靈敏度的相思子毒素檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 相思子毒素、蓖麻毒素、蒴蓮根毒素、BALB/c小鼠、Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞系由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物所提供。胎牛血清、1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；Protein A-Sepharose CL-4B為GE公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 BALB/c小鼠的抗原免疫 利用甲醛處理的相思子毒素毒蛋白作為抗原，經(jīng)腹腔注射免疫10只雌性BALB/c小鼠。初次免疫用弗氏完全佐劑乳化的抗原，3周后用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進(jìn)行第2次免疫，再過(guò)3周同樣用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進(jìn)行第3次免疫，3次免疫劑量均為100μg/只。每次免疫3次后后段尾靜脈采血，用間接ELISA方法檢測(cè)血清中的抗體效價(jià)，觀測(cè)免疫效果。

1.2.2 雜交瘤細(xì)胞的建立 細(xì)胞融合前2d用抗原于小鼠尾靜脈加強(qiáng)免疫1次，取小鼠脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞采用50%PEG2000融合按常規(guī)方法進(jìn)行融合。

1.2.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆 以10 μg/ml的相思子毒素為包被抗原，用ELISA方法，通過(guò)檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清篩選陽(yáng)性融合細(xì)胞，再對(duì)陽(yáng)性孔中的細(xì)胞以有限稀釋法進(jìn)行3次細(xì)胞克隆，用抗體亞類(lèi)測(cè)定試劑盒對(duì)克隆獲得的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行抗體亞類(lèi)鑒定。將經(jīng)過(guò)抗體亞類(lèi)鑒定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株接種到預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔中，制備腹水，并測(cè)定其分泌單抗的穩(wěn)定性。取生長(zhǎng)良好，分泌穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞建株，擴(kuò)大培養(yǎng)后入液氮保存。

1.2.4 單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定 分別將用不同的單克隆雜交瘤細(xì)胞株誘生的小鼠腹水行1/100稀釋?zhuān)缓笤僖?/10稀釋率進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)灰韵嗨甲佣舅貫榘豢乖瑧?yīng)用間接ELISA方法進(jìn)行抗體的效價(jià)檢測(cè)。

1.2.5 單克隆抗體的特異性鑒定 利用間接ELISA法，分別測(cè)定單抗與蓖麻毒素、蒴蓮根毒素的交叉反應(yīng)性。各種抗原按5 μg/ml的濃度包被96孔酶標(biāo)板，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.6 單克隆抗體的純化 應(yīng)用A蛋白親和層析法純化腹水中的單克隆抗體。將腹水先通過(guò)硫酸銨沉淀進(jìn)行預(yù)處理，然后用ProteinA-Sepharose CL-4B親和層析，通過(guò)AKTA explorer100監(jiān)測(cè)純化色譜圖。

1.2.7 單克隆抗體的定量和SDS-PAGE鑒定 將純化獲得的單抗用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定抗體的濃度，并推算腹水中單抗的含量，并進(jìn)行SDSPAGE鑒定

2 結(jié) 果

2.1 免疫效果分析 用間接ELISA法對(duì)免疫后的小鼠血清抗體效價(jià)檢測(cè)表明，末次免疫小鼠血清抗體效價(jià)均在1∶8000以上，免疫效果良好，可以用于細(xì)胞融合。

2.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立 通過(guò)對(duì)融合后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)和篩選，并對(duì)陽(yáng)性孔中的細(xì)胞經(jīng)過(guò)有限稀釋法進(jìn)行3次細(xì)胞克隆，結(jié)果顯示細(xì)胞融合率為78%，其中陽(yáng)性細(xì)胞孔為8個(gè)，陽(yáng)性率為7.2%。對(duì)4株強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行3次亞克隆后，得到4株單抗細(xì)胞株2D3、4E6、1C8和1E5。

2.3 單抗的亞類(lèi)鑒定 根據(jù)抗體亞類(lèi)測(cè)定試劑盒的方法， 分別用抗鼠 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA試劑包被96孔酶標(biāo)板，測(cè)得2D3細(xì)胞株的亞類(lèi)是 IgG1，4E6、1C8和 1E5細(xì)胞株的亞類(lèi)均為Ig2b。

2.4 單抗的效價(jià)測(cè)定 用間接ELISA法分別對(duì)2D3、4E6、1C8和1E5雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，分別為 1∶1×107、1∶1×106、1∶1×105、1∶1×106。

2.5 單抗的特異性鑒定 利用間接ELISA法，分別測(cè)定單抗與蓖麻毒素、蒴蓮根毒素的交叉反應(yīng)性。結(jié)果表明，4株單抗與幾種毒素均無(wú)交叉反應(yīng)，說(shuō)明所篩選出的單克隆抗體是特異的。

2.6 單克隆抗體的純化 AKTA explorer100監(jiān)測(cè)的純化色譜圖顯示，2D3細(xì)胞誘生的腹水經(jīng)蛋白A親和層析純化，獲得了單一的蛋白洗脫峰（圖1）。通過(guò)BCA蛋白定量試劑盒對(duì)純化抗體進(jìn)行定量測(cè)定，推算出腹水中單抗含量約為4.6 mg/ml。

圖1 Protein A-Sepharose CL-4B層析圖

2.7 單克隆抗體的SDS-PAGE鑒定 純化的單抗進(jìn)行還原性SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示：5倍稀釋腹水的SDS-PAGE結(jié)果為多條帶，純化后的IgG只有2條帶，上下2條帶分別為IgG的重鏈及輕鏈（圖2），分子量分別是 50、26 kDa，與理論值相符合。

圖2 純化單抗的SDS-PAGE鑒定結(jié)果

3 討 論

相思子毒素 （abrin）是存在于豆科植物相思（Abrus precatorius）種子中的一種毒蛋白，與蓖麻毒素（ricin）同為Ⅱ型核糖體失活蛋白（RIP）家族成員，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的植物毒素之一，毒性是普通化學(xué)武器的幾百倍。從第一次世界大戰(zhàn)起，經(jīng)美、英、加、法等國(guó)的研究，相思子毒素已經(jīng)成為一個(gè)成功的天然毒素戰(zhàn)劑[9，10]。

相思子毒素天然資源比較豐富，制備比較容易，并且借助當(dāng)今高度發(fā)達(dá)的生物工程技術(shù)手段，還能夠?qū)崿F(xiàn)大批量生產(chǎn)。相思子毒素中毒后無(wú)特異癥狀，出現(xiàn)癥狀時(shí)已經(jīng)造成機(jī)體嚴(yán)重的器質(zhì)性損害，給中毒的治療及預(yù)防帶來(lái)極大的難度，具備生物毒素武器典型特征，因此歷來(lái)為外軍所高度重視[3]。在2001年世界生物及毒素武器大會(huì)（BTWC）上，相思子毒素再次被列入重點(diǎn)核查清單，因此開(kāi)展對(duì)相思子毒素的研究具有十分重要的意義[11，12]。

本研究利用相思子毒素免疫BALB/C小鼠制備了相思子毒素單克隆抗體，其與相思子毒素、蒴蓮根毒素?zé)o交叉反應(yīng)，表明此株單抗特異性較強(qiáng)，具備建立檢測(cè)試劑盒的可能，可作為檢測(cè)相思子毒素的核心試劑。

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