焦 穎,龔勁峰,何校澎,黃輝榮,劉德輝,張春紅,吳 鋒,黃毓茂

(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣東廣州 510642)

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬,病毒粒子呈球形,非嚴格的正 20面體。完整的病毒衣殼由VP1、VP2、VP3和VP4等 4種結(jié)構(gòu)蛋白各60個分子組成[1]。O型FMDV至少有5個抗原表位,其中有3個存在于VP1上,分別為 B細胞抗原表位(141 aa～160 aa)、T細胞抗原表位(200 aa～213 aa)以及位于VP1蛋白的pB-C環(huán)上的抗原表位(40 aa～60 aa),均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體[2-3]。由于VP1基因為FMDV主要的免疫原性基因,常被用于FMDV基因工程亞單位疫苗的靶基因。然而,國內(nèi)對O型FMDV VP1基因的研究報道多以該基因的克隆表達和該基因的幾個抗原表位的表達、免疫原性研究為主,而對VP1全基因進行真核表達并作免疫原性研究的報道較少[4]。因此,O型FMDV VP1全基因疫苗的研究對于預(yù)防口蹄疫仍具有重要的應(yīng)用價值。

目前,我國控制該病的流行主要通過疫苗預(yù)防接種的方法,然而至今尚未有成熟的口蹄疫基因工程疫苗產(chǎn)品代替?zhèn)鹘y(tǒng)疫苗。因此,開發(fā)免疫原性更好、價格更為低廉的新型疫苗依然有其緊迫性。畢赤酵母(Pichia pastoris)作為一種較為成熟的表達系統(tǒng),具有原核生物生長快、易工業(yè)化的特點,并具備高效的表達量、良好的發(fā)酵與分泌性能,同時具有真核細胞表達系統(tǒng)的修飾功能,表達產(chǎn)物生物學活性好等優(yōu)點[5]。鑒于此,本研究將FMDV VP1基因插入到pPICZα-C表達載體上,通過電激轉(zhuǎn)化整合到X-33菌的基因組中,篩選出高效表達的工程菌,并研究其免疫學活性,為研制FMDV酵母基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性Balb/c小鼠,6周齡～8周齡,購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 畢赤酵母受體菌X-33(H is-/Mut+)、表達載體pPICZα-C購于Invitrogen公司;大腸埃希菌(Escherichia coli)DH 5α為華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院實驗室保存。含有O型FMDV VP1基因表達盒的重組質(zhì)粒pMD-L-2A,由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院龔勁峰構(gòu)建并保存。

1.1.3 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、T DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、XbaⅠ、SacⅠ以及預(yù)染蛋白質(zhì)低分子標準購自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司;Zeocin購自Invitrogen公司;H RP標記的兔抗豬IgG抗體購于晶美生物技術(shù)有限公司;弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購自Sigm a公司,O型口蹄疫ELISA檢測試劑盒為PRIONICS公司產(chǎn)品,FMDV抗體標準陽性的免疫豬血清為O型FMD正向間接血凝抗原試劑盒購于中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所,其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物 參照GenBank上注冊的O型FMDV基因組序列(HKN/2002),使用Primer Premier 5.0設(shè)計了1對引物 P1、P2,在 5′端設(shè)計了 Xho Ⅰ酶切位點并引入Kex2、Ste13蛋白酶裂解位點,以確保信號肽的完整切割,獲得目的蛋白。3′端設(shè)計了XbaⅠ酶切位點,序列全長為677 bp。

P1:5′–CCCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTACCACCTCTGCGGGTGAGTCT-3′;

P2:5′-GCTCTAGATCACTGTTTTGCGGGTGCCA-3′。

1.2.2 重組酵母表達載體的構(gòu)建 以質(zhì)粒pMDL-2A為模板,用P1和P2引物進行PCR擴增,將獲得的VP1基因片段用XhoⅠ和XbaⅠ酶切,瓊脂糖凝膠電泳回收后,將FMDV VP1基因片段克隆入表達載體pPICZα-C的XhoⅠ和XbaⅠ位點,轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細胞。經(jīng)篩選鑒定為陽性的克隆,進行基因序列的分析鑒定。

1.2.3 攜帶目的基因的重組酵母的構(gòu)建 采用電穿孔轉(zhuǎn)化法,將SacⅠ線性化后的質(zhì)粒pPICZαCVP1與感受態(tài)Pichia pastoris X-33(His-/M ut+)混合,轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中,置冰上5min,1.5 kV電擊 5 m s。電轉(zhuǎn)化后立即加入1mL預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇,輕輕混勻后將轉(zhuǎn)化物移入5mL的培養(yǎng)管。30℃靜置培養(yǎng)0.5 h,然后加入1mL YPD液體,30℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)0.5 h。離心收集菌體,用含有100 mg/L ZeocinTMYPD平板進行篩選,于30℃溫箱中培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)(需要3 d～5 d)。

1.2.4 重組畢赤酵母菌的誘導(dǎo)表達 將篩選到的具有Zeocin抗性的單菌落接種到30mL的BMGY液體培養(yǎng)基中進行激活培養(yǎng),于30℃以200 r/min振蕩過夜,至OD600=2～6,此時細胞處于對數(shù)生長期。3 000 r/min離心5min收集沉淀,重懸于3mL的BMMY中,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。期間每隔24 h加入純甲醇至終濃度為10 mL/L,進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。96 h后,3 000 r/min離心5min,收集培養(yǎng)液上清,進行表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析,用考馬斯亮藍R-250染色及凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5 SDS-PAGE和Western blot檢測 取重組酵母菌發(fā)酵上清,經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。滴加50 g/L脫脂奶粉溶液于室溫封閉90 min。洗膜后,加入一抗為O型FMD標準陽性血清(1∶200稀釋于10 g/L脫脂奶粉溶液/TBS溶液),室溫緩慢振搖過夜。洗膜后,加入按1∶1 000稀釋的HRP標記羊抗豬酶標二抗,室溫緩慢振搖作用至少2 h。最后加DAB作用5 min顯色后,用蒸餾水洗滌終止反應(yīng),觀察結(jié)果。

1.2.6 動物免疫試驗 選用 Balb/c小鼠30只,隨機分為5組,每組6只。分組如下:A組為亞單位疫苗,將重組酵母表達上清分別與弗氏完全(不完全)佐劑疫苗混合、乳化,使VP1蛋白其濃度為1μL,100μg/只;B組為單純注射重組酵母表達上清,注射劑量為100μg/只;C組為商品口蹄疫合成肽疫苗,按照商品說明動物重量計算注射劑量為20μL/只;D組-酵母空載體苗,用弗氏佐劑與酵母空載體表達上清混合制成乳劑,100μg/只;E組為PBS空白對照組,注射劑量100μL/只。以上各組疫苗多點注射于小鼠背部皮下。

1.2.7 免疫小鼠體液免疫應(yīng)答的檢測 于免疫接種后第2、4、6周,各組小鼠均經(jīng)斷尾采血,離心分離血清,用ELISA試劑盒檢測血清抗FMDV VP1蛋白抗體的滴度。將試劑盒中的二抗換為1∶1 000 HRP標記的山羊抗小鼠IgG。最后用酶標檢測儀進行測定,數(shù)據(jù)用SAS生物統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 重組酵母表達載體的構(gòu)建

利用特異性的引物 P1、P2進行PCR擴增,于8 g/L的瓊脂糖中電泳檢測,得到一條特異的DNA帶,大小約為677 bp(圖1),與預(yù)期的結(jié)果相符?；厥盏腣P1基因經(jīng)定向插入酵母表達載體pPICZα-C,用XhoⅠ、XbaⅠ雙酶切,SacⅠ單酶切瓊脂糖中電泳檢測,出現(xiàn)約677 bp的條帶(圖2),與預(yù)期結(jié)果相符,最后送檢測序,結(jié)果證明為陽性重組質(zhì)粒,命名為pPICZαC-VP1。

圖1 VP1基因PCR的擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR productsof VP1 gene

圖2 重組質(zhì)粒pPICZαC-VP1的酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pPICZαC-VP1

2.2 重組酵母誘導(dǎo)表達VP1基因的鑒定

將含pPICZαC-VP1質(zhì)粒的陽性重組酵母進行誘導(dǎo)表達,取表達上清經(jīng) SDS-PAGE進行檢測分析,與誘導(dǎo)的pPICZα-C空載體轉(zhuǎn)化重組酵母菌表達上清比較,在70.0 ku附近可見一條特異的蛋白質(zhì)條帶,與預(yù)期蛋白的大小一致(圖3),薄層掃描系統(tǒng)分析,計算得到目的蛋白表達量最高為25.2 mg/L。Western blot印跡表明,該蛋白能與O型FMDV陽性血清發(fā)生特異反應(yīng),具有抗原性(圖4)。

2.3 免疫小鼠體液免疫應(yīng)答水平檢測

從圖5可見,接種自制VP1亞單位疫苗(A)的小鼠二免后與對照組(D、E)相比,小鼠血清中產(chǎn)生FMDV特異性抗體,但明顯低于商品化合成肽疫苗組,而單純注射陽性重組酵母表達上清的小鼠僅產(chǎn)生微弱的抗體。酵母空載體和PBS組抗體水平接近,證明載體對小鼠機體無非特異抗原刺激。

3 討論

畢赤酵母(Pichia pastoris)基因工程的表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展很快的一個真核表達系統(tǒng),其應(yīng)用越來越廣泛。目前已有HBsAg、TNF基因工程抗體等400多種外源基因在該系統(tǒng)中表達,不乏每升克級以上的表達[6]。有研究表明,畢赤酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)表達量是搖瓶培養(yǎng)的10倍以上[7]。酵母表達載體有多種,本試驗選用的pPICZαC分泌型表達載體,可通過整合型載體將外源基因整合到酵母染色體上,獲得遺傳性穩(wěn)定重組子。外源基因在酵母中的表達一般是采用酵母基因的啟動子,而且能通過前導(dǎo)信號肽引導(dǎo)外源蛋白的分泌表達,并能識別及有效地切割這些信號肽[8-9]。由于畢赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少[10],本研究在構(gòu)建重組載體時,未加上純化用的標簽,這主要是擔心標簽可能會影響蛋白質(zhì)折疊,從而影響目的蛋白的生物活性[11]。研究結(jié)果表明,在多步篩選后,得到的陽性菌株十分理想,分泌表達的目的蛋白量高,雜蛋白質(zhì)少。

在大容量、高密度培養(yǎng)過程中,為提高酵母的表達量,需要將細胞擴增與表達階段分開。在生物量擴增階段,只加少量甘油就能滿足細胞快速生長,抑制AOX的表達;在表達階段加入甲醇,目的蛋白就能得到誘導(dǎo)表達,這時酵母生長極其緩慢[12]。由于畢赤酵母的高密度培養(yǎng)和長時間的誘導(dǎo)表達會導(dǎo)致蛋白水解酶升高,后者會引起表達產(chǎn)物降解、變性失活[13],最終獲得目的蛋白產(chǎn)量低于預(yù)期。本研究采用低溫濃縮誘導(dǎo)表達的方式,通過降低誘導(dǎo)期間的溫度使酵母細胞比在30℃條件下誘導(dǎo)的死亡數(shù)量下降,從而減少蛋白酶的釋放,降低發(fā)酵液中蛋白酶的活性,減輕對目的蛋白的降解,間接提高了表達量[14-15]。

本研究成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒 pPICZαCVP1,實現(xiàn)了VP1基因在畢赤酵母中的高水平分泌表達,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測表明表達的蛋白能與抗FMD陽性標準血清發(fā)生特異性反應(yīng)。在動物試驗中,由于未純化蛋白,為排除酵母自體蛋白的影響,特別設(shè)立酵母空載體對照組。動物免疫試驗表明,利用重組酵母表達的目的蛋白作為免疫原,能刺激小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答。酵母空載體和PBS組抗體水平接近,證明載體對小鼠機體無非特異抗原刺激。以上研究成果,為解決口蹄疫疫苗規(guī)?；a(chǎn),降低生成成本,并將其應(yīng)用到臨床等提供了試驗基礎(chǔ)。

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