焦 穎,龔勁峰,何校澎,黃輝榮,劉德輝,張春紅,吳 鋒,黃毓茂

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬,病毒粒子呈球形,非嚴(yán)格的正 20面體。完整的病毒衣殼由VP1、VP2、VP3和VP4等 4種結(jié)構(gòu)蛋白各60個(gè)分子組成[1]。O型FMDV至少有5個(gè)抗原表位,其中有3個(gè)存在于VP1上,分別為 B細(xì)胞抗原表位(141 aa～160 aa)、T細(xì)胞抗原表位(200 aa～213 aa)以及位于VP1蛋白的pB-C環(huán)上的抗原表位(40 aa～60 aa),均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[2-3]。由于VP1基因?yàn)镕MDV主要的免疫原性基因,常被用于FMDV基因工程亞單位疫苗的靶基因。然而,國(guó)內(nèi)對(duì)O型FMDV VP1基因的研究報(bào)道多以該基因的克隆表達(dá)和該基因的幾個(gè)抗原表位的表達(dá)、免疫原性研究為主,而對(duì)VP1全基因進(jìn)行真核表達(dá)并作免疫原性研究的報(bào)道較少[4]。因此,O型FMDV VP1全基因疫苗的研究對(duì)于預(yù)防口蹄疫仍具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前,我國(guó)控制該病的流行主要通過(guò)疫苗預(yù)防接種的方法,然而至今尚未有成熟的口蹄疫基因工程疫苗產(chǎn)品代替?zhèn)鹘y(tǒng)疫苗。因此,開(kāi)發(fā)免疫原性更好、價(jià)格更為低廉的新型疫苗依然有其緊迫性。畢赤酵母(Pichia pastoris)作為一種較為成熟的表達(dá)系統(tǒng),具有原核生物生長(zhǎng)快、易工業(yè)化的特點(diǎn),并具備高效的表達(dá)量、良好的發(fā)酵與分泌性能,同時(shí)具有真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的修飾功能,表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性好等優(yōu)點(diǎn)[5]。鑒于此,本研究將FMDV VP1基因插入到pPICZα-C表達(dá)載體上,通過(guò)電激轉(zhuǎn)化整合到X-33菌的基因組中,篩選出高效表達(dá)的工程菌,并研究其免疫學(xué)活性,為研制FMDV酵母基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性Balb/c小鼠,6周齡～8周齡,購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 畢赤酵母受體菌X-33(H is-/Mut+)、表達(dá)載體pPICZα-C購(gòu)于Invitrogen公司;大腸埃希菌(Escherichia coli)DH 5α為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。含有O型FMDV VP1基因表達(dá)盒的重組質(zhì)粒pMD-L-2A,由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院龔勁峰構(gòu)建并保存。

1.1.3 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、T DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、XbaⅠ、SacⅠ以及預(yù)染蛋白質(zhì)低分子標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司;Zeocin購(gòu)自Invitrogen公司;H RP標(biāo)記的兔抗豬IgG抗體購(gòu)于晶美生物技術(shù)有限公司;弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigm a公司,O型口蹄疫ELISA檢測(cè)試劑盒為PRIONICS公司產(chǎn)品,FMDV抗體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性的免疫豬血清為O型FMD正向間接血凝抗原試劑盒購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物 參照GenBank上注冊(cè)的O型FMDV基因組序列(HKN/2002),使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了1對(duì)引物 P1、P2,在 5′端設(shè)計(jì)了 Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)并引入Kex2、Ste13蛋白酶裂解位點(diǎn),以確保信號(hào)肽的完整切割,獲得目的蛋白。3′端設(shè)計(jì)了XbaⅠ酶切位點(diǎn),序列全長(zhǎng)為677 bp。

P1:5′–CCCTCGAGAAGAGAGAGGCTGAAGCTACCACCTCTGCGGGTGAGTCT-3′;

P2:5′-GCTCTAGATCACTGTTTTGCGGGTGCCA-3′。

1.2.2 重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 以質(zhì)粒pMDL-2A為模板,用P1和P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將獲得的VP1基因片段用XhoⅠ和XbaⅠ酶切,瓊脂糖凝膠電泳回收后,將FMDV VP1基因片段克隆入表達(dá)載體pPICZα-C的XhoⅠ和XbaⅠ位點(diǎn),轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)篩選鑒定為陽(yáng)性的克隆,進(jìn)行基因序列的分析鑒定。

1.2.3 攜帶目的基因的重組酵母的構(gòu)建 采用電穿孔轉(zhuǎn)化法,將SacⅠ線性化后的質(zhì)粒pPICZαCVP1與感受態(tài)Pichia pastoris X-33(His-/M ut+)混合,轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中,置冰上5min,1.5 kV電擊 5 m s。電轉(zhuǎn)化后立即加入1mL預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇,輕輕混勻后將轉(zhuǎn)化物移入5mL的培養(yǎng)管。30℃靜置培養(yǎng)0.5 h,然后加入1mL YPD液體,30℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)0.5 h。離心收集菌體,用含有100 mg/L ZeocinTMYPD平板進(jìn)行篩選,于30℃溫箱中培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)(需要3 d～5 d)。

1.2.4 重組畢赤酵母菌的誘導(dǎo)表達(dá) 將篩選到的具有Zeocin抗性的單菌落接種到30mL的BMGY液體培養(yǎng)基中進(jìn)行激活培養(yǎng),于30℃以200 r/min振蕩過(guò)夜,至OD600=2～6,此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。3 000 r/min離心5min收集沉淀,重懸于3mL的BMMY中,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。期間每隔24 h加入純甲醇至終濃度為10 mL/L,進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。96 h后,3 000 r/min離心5min,收集培養(yǎng)液上清,進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析,用考馬斯亮藍(lán)R-250染色及凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5 SDS-PAGE和Western blot檢測(cè) 取重組酵母菌發(fā)酵上清,經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)后,電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。滴加50 g/L脫脂奶粉溶液于室溫封閉90 min。洗膜后,加入一抗為O型FMD標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清(1∶200稀釋于10 g/L脫脂奶粉溶液/TBS溶液),室溫緩慢振搖過(guò)夜。洗膜后,加入按1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗豬酶標(biāo)二抗,室溫緩慢振搖作用至少2 h。最后加DAB作用5 min顯色后,用蒸餾水洗滌終止反應(yīng),觀察結(jié)果。

1.2.6 動(dòng)物免疫試驗(yàn) 選用 Balb/c小鼠30只,隨機(jī)分為5組,每組6只。分組如下:A組為亞單位疫苗,將重組酵母表達(dá)上清分別與弗氏完全(不完全)佐劑疫苗混合、乳化,使VP1蛋白其濃度為1μL,100μg/只;B組為單純注射重組酵母表達(dá)上清,注射劑量為100μg/只;C組為商品口蹄疫合成肽疫苗,按照商品說(shuō)明動(dòng)物重量計(jì)算注射劑量為20μL/只;D組-酵母空載體苗,用弗氏佐劑與酵母空載體表達(dá)上清混合制成乳劑,100μg/只;E組為PBS空白對(duì)照組,注射劑量100μL/只。以上各組疫苗多點(diǎn)注射于小鼠背部皮下。

1.2.7 免疫小鼠體液免疫應(yīng)答的檢測(cè) 于免疫接種后第2、4、6周,各組小鼠均經(jīng)斷尾采血,離心分離血清,用ELISA試劑盒檢測(cè)血清抗FMDV VP1蛋白抗體的滴度。將試劑盒中的二抗換為1∶1 000 HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG。最后用酶標(biāo)檢測(cè)儀進(jìn)行測(cè)定,數(shù)據(jù)用SAS生物統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 重組酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

利用特異性的引物 P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,于8 g/L的瓊脂糖中電泳檢測(cè),得到一條特異的DNA帶,大小約為677 bp(圖1),與預(yù)期的結(jié)果相符?；厥盏腣P1基因經(jīng)定向插入酵母表達(dá)載體pPICZα-C,用XhoⅠ、XbaⅠ雙酶切,SacⅠ單酶切瓊脂糖中電泳檢測(cè),出現(xiàn)約677 bp的條帶(圖2),與預(yù)期結(jié)果相符,最后送檢測(cè)序,結(jié)果證明為陽(yáng)性重組質(zhì)粒,命名為pPICZαC-VP1。

圖1 VP1基因PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR productsof VP1 gene

圖2 重組質(zhì)粒pPICZαC-VP1的酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of the recombinant plasmid pPICZαC-VP1

2.2 重組酵母誘導(dǎo)表達(dá)VP1基因的鑒定

將含pPICZαC-VP1質(zhì)粒的陽(yáng)性重組酵母進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),取表達(dá)上清經(jīng) SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)分析,與誘導(dǎo)的pPICZα-C空載體轉(zhuǎn)化重組酵母菌表達(dá)上清比較,在70.0 ku附近可見(jiàn)一條特異的蛋白質(zhì)條帶,與預(yù)期蛋白的大小一致(圖3),薄層掃描系統(tǒng)分析,計(jì)算得到目的蛋白表達(dá)量最高為25.2 mg/L。Western blot印跡表明,該蛋白能與O型FMDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異反應(yīng),具有抗原性(圖4)。

2.3 免疫小鼠體液免疫應(yīng)答水平檢測(cè)

從圖5可見(jiàn),接種自制VP1亞單位疫苗(A)的小鼠二免后與對(duì)照組(D、E)相比,小鼠血清中產(chǎn)生FMDV特異性抗體,但明顯低于商品化合成肽疫苗組,而單純注射陽(yáng)性重組酵母表達(dá)上清的小鼠僅產(chǎn)生微弱的抗體。酵母空載體和PBS組抗體水平接近,證明載體對(duì)小鼠機(jī)體無(wú)非特異抗原刺激。

3 討論

畢赤酵母(Pichia pastoris)基因工程的表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)展很快的一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng),其應(yīng)用越來(lái)越廣泛。目前已有HBsAg、TNF基因工程抗體等400多種外源基因在該系統(tǒng)中表達(dá),不乏每升克級(jí)以上的表達(dá)[6]。有研究表明,畢赤酵母高密度發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)量是搖瓶培養(yǎng)的10倍以上[7]。酵母表達(dá)載體有多種,本試驗(yàn)選用的pPICZαC分泌型表達(dá)載體,可通過(guò)整合型載體將外源基因整合到酵母染色體上,獲得遺傳性穩(wěn)定重組子。外源基因在酵母中的表達(dá)一般是采用酵母基因的啟動(dòng)子,而且能通過(guò)前導(dǎo)信號(hào)肽引導(dǎo)外源蛋白的分泌表達(dá),并能識(shí)別及有效地切割這些信號(hào)肽[8-9]。由于畢赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少[10],本研究在構(gòu)建重組載體時(shí),未加上純化用的標(biāo)簽,這主要是擔(dān)心標(biāo)簽可能會(huì)影響蛋白質(zhì)折疊,從而影響目的蛋白的生物活性[11]。研究結(jié)果表明,在多步篩選后,得到的陽(yáng)性菌株十分理想,分泌表達(dá)的目的蛋白量高,雜蛋白質(zhì)少。

在大容量、高密度培養(yǎng)過(guò)程中,為提高酵母的表達(dá)量,需要將細(xì)胞擴(kuò)增與表達(dá)階段分開(kāi)。在生物量擴(kuò)增階段,只加少量甘油就能滿足細(xì)胞快速生長(zhǎng),抑制AOX的表達(dá);在表達(dá)階段加入甲醇,目的蛋白就能得到誘導(dǎo)表達(dá),這時(shí)酵母生長(zhǎng)極其緩慢[12]。由于畢赤酵母的高密度培養(yǎng)和長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致蛋白水解酶升高,后者會(huì)引起表達(dá)產(chǎn)物降解、變性失活[13],最終獲得目的蛋白產(chǎn)量低于預(yù)期。本研究采用低溫濃縮誘導(dǎo)表達(dá)的方式,通過(guò)降低誘導(dǎo)期間的溫度使酵母細(xì)胞比在30℃條件下誘導(dǎo)的死亡數(shù)量下降,從而減少蛋白酶的釋放,降低發(fā)酵液中蛋白酶的活性,減輕對(duì)目的蛋白的降解,間接提高了表達(dá)量[14-15]。

本研究成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒 pPICZαCVP1,實(shí)現(xiàn)了VP1基因在畢赤酵母中的高水平分泌表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)表明表達(dá)的蛋白能與抗FMD陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清發(fā)生特異性反應(yīng)。在動(dòng)物試驗(yàn)中,由于未純化蛋白,為排除酵母自體蛋白的影響,特別設(shè)立酵母空載體對(duì)照組。動(dòng)物免疫試驗(yàn)表明,利用重組酵母表達(dá)的目的蛋白作為免疫原,能刺激小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答。酵母空載體和PBS組抗體水平接近,證明載體對(duì)小鼠機(jī)體無(wú)非特異抗原刺激。以上研究成果,為解決口蹄疫疫苗規(guī)模化生產(chǎn),降低生成成本,并將其應(yīng)用到臨床等提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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