馮若飛,馬忠仁,喬自林,李明生,李 佳,馮玉萍,龍 玲,林學(xué)仕

(1.西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730030;2.甘肅省永靖縣畜牧獸醫(yī)工作站,甘肅臨夏 731600)

日本腦炎(Japanese encephalitis,JE)又稱(chēng)流行性乙型腦炎(Epidemic encephalitis B),簡(jiǎn)稱(chēng)乙腦,是一種人與動(dòng)物共患的蚊媒病毒性疾病,該病由黃病毒科黃病毒屬B組蟲(chóng)媒病毒中日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的。該病最早發(fā)現(xiàn)于日本,主要在夏秋季節(jié)流行,曾稱(chēng)為“夏季腦炎”,目前主要發(fā)生及流行于遠(yuǎn)東及東南亞國(guó)家和地區(qū),對(duì)人類(lèi)危害巨大。在中國(guó)、日本和其他西太平洋國(guó)家中,JE是人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的最常見(jiàn)的蟲(chóng)媒病之一[1]。

JE對(duì)養(yǎng)豬業(yè)及人類(lèi)健康造成巨大危害。我國(guó)動(dòng)物感染JEV的區(qū)域和范圍亦較廣,很多種動(dòng)物如豬、馬、牛、山羊、綿羊、猴和家禽很易感染日本腦炎,其他如兔、大鼠、鴿、犬、鴨、野禽和爬行類(lèi)也易感,小鼠和某些蜥蝎能被試驗(yàn)感染。1924年夏,日本和朝鮮暴發(fā)大規(guī)模的日本腦炎,病死率達(dá) 80%左右;1958年,越南發(fā)生日本腦炎流行[2]。我國(guó)是日本腦炎發(fā)病人數(shù)最多的國(guó)家之一,占世界總數(shù)的80%以上[3],全國(guó)各地區(qū)都有發(fā)生[4-6]。本病主要是危害學(xué)齡兒童,引起致死性腦炎。而近年來(lái)有向成人發(fā)展的趨勢(shì),尤其是老人,以腦病、循環(huán)衰竭為主要特征,病死率高達(dá)66%左右;懷孕婦女感染JEV能導(dǎo)致流產(chǎn)。約有30%的患者愈后殘留有不同程度的后遺癥,主要表現(xiàn)是意識(shí)障礙、癡呆、失語(yǔ)及肢體癱瘓。豬在JE流行環(huán)節(jié)中是主要傳染來(lái)源,是主要的擴(kuò)散宿主,在散播病毒方面起著非常重要的作用,蚊蟲(chóng)可以通過(guò)叮咬來(lái)傳播JEV[7]。豬感染JEV后潛伏期3 d～4 d,患病幼畜高熱稽留,精神沉郁,步行踉蹌,最后身軀麻痹而死;育肥豬持續(xù)高熱;妊娠母豬主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔;公豬的睪丸腫大,局部發(fā)熱,最后萎縮變硬[1]。

因此,JE的流行病學(xué)調(diào)查、診斷和防控對(duì)規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有重大的意義,也具有重大的公共衛(wèi)生學(xué)意義。目前,甘肅省對(duì)人及豬感染此病的調(diào)查較少,僅天水市2003年對(duì)人患JE進(jìn)行了調(diào)查。甘肅省獸醫(yī)總站2000年曾應(yīng)用紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)對(duì)甘肅省14個(gè)地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)JE的血清學(xué)進(jìn)行了檢測(cè)。為了進(jìn)一步掌握甘肅省豬群中感染發(fā)展變化情況,進(jìn)行了如下調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣品 2008年6月～10月期間收集甘肅省部分地區(qū)3月齡以下豬血清樣本422份,標(biāo)記PA組,3月齡以上豬血清樣本836份,標(biāo)記PB組,所有樣品均保存在-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 抗原及陰陽(yáng)性對(duì)照血清 抗原SA 14-14-2減毒活疫苗購(gòu)自蘭州生物制品研究所;陰性、陽(yáng)性血清為西北民族大學(xué)生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.3 試劑與耗材 包被緩沖液(0.05 moL/L,pH 9.56,500 mL),洗液(20×),酶稀釋液,A+B底物顯色液,HRP-兔抗豬IgG為北京拜爾迪公司產(chǎn)品,封閉液,M EM細(xì)胞培養(yǎng)液和2.5 g/L胰蛋白酶(Gibco),96孔酶標(biāo)板等。

1.1.4 儀器設(shè)備 MK 3酶標(biāo)定量測(cè)定儀為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品,ZMX-988B全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)為北京天石公司產(chǎn)品。

1.1.5 細(xì)胞 BHK-21細(xì)胞為甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備 將JEV減毒活疫苗用MEM復(fù)溶并稀釋,接種于BHK-21細(xì)胞中,37℃轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)4 d～5 d后開(kāi)始觀察,待病變達(dá)75%以上收毒,反復(fù)凍融3次,3 500 r/min離心10 min,收取上清并過(guò)濾除菌,置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 包被、封閉 上述病毒液進(jìn)行濃縮純化,測(cè)定病毒滴度,稀釋后37℃包被;包被完成后分別加入含有牛血清白蛋白(BSA)的封閉緩沖液,4℃過(guò)夜。

1.2.3 檢測(cè) 用生理鹽水(1∶40)稀釋待檢血清,每樣2孔,設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各3孔,空白對(duì)照2孔,每孔100μL?？瞻讓?duì)照加生理鹽水。將加好樣的板放在37℃溫箱卵育1 h,酶標(biāo)洗板5次,浸泡時(shí)間為60 s;每孔加入100μL HRP-兔抗豬酶標(biāo)二抗(1∶1 000),37℃溫箱卵育1 h,酶標(biāo)洗板5次,浸泡 60 s;每孔加入 A、B底物顯色液各 1滴(50μL),室溫避光顯色15min,每孔再加入50μL終止液終止反應(yīng),使用酶標(biāo)定量測(cè)定儀采用450 nm/630 nm雙波長(zhǎng)讀數(shù)并分析。

2 結(jié)果

2.1 甘肅省不同地區(qū)豬JE抗體檢測(cè)結(jié)果

對(duì)甘肅省內(nèi)10個(gè)地區(qū)1 258份豬血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果陽(yáng)性922份,總陽(yáng)性率為73.3%,結(jié)果見(jiàn)表1。其中,隴南和天水為最高,抗體陽(yáng)性率分別為81.2%、81.8%,高于平均陽(yáng)性率的地區(qū)還有蘭州和白銀地區(qū);甘南、酒泉最低,分別為50%、52.6%,其他地區(qū)均接近平均陽(yáng)性率。這些差異可能源于地區(qū)氣候差異,隴南、天水夏季濕潤(rùn)高溫,適宜蚊蠅孳生,這也符合JE的流行特點(diǎn)。3月齡以下豬JE抗體總陽(yáng)性率為63.7%,3月齡以上豬血清中JE抗體總陽(yáng)性率為78.1%,通過(guò)t檢驗(yàn),二者差異極顯著。

表1 甘肅省不同地區(qū)豬血清JEV抗體檢測(cè)結(jié)果Table1 Detecing resu lts of an ti-JEV antibody among pigs in different regions of Gansu province

2.2 甘肅省不同地區(qū)豬JE抗體陽(yáng)性強(qiáng)度比較

通過(guò)比對(duì)各地區(qū)感染強(qiáng)度,結(jié)果見(jiàn)表2。發(fā)現(xiàn)3月齡以下豬JEV抗體水平強(qiáng)度較低,S/CO值基本都小于5,而3月齡以上強(qiáng)度有所加強(qiáng),均高于3月齡以下豬群?？傮w上,所有地區(qū)抗體強(qiáng)度S/CO≤5比率較高。

表2 甘肅省不同地區(qū)豬JEV陽(yáng)性抗體強(qiáng)度比較(S/CO值=OD/cutoff值)Table2 Comparison of anti-JEV antibody density among pigs in different regions of Gansu province

3 討論

經(jīng)統(tǒng)計(jì)甘肅省豬群JEV感染率為73.3%,這一感染率比北京[8]、珠海[9]、河北、山西[10]要高,略低于麗水市[11]、上海市[12]等。2000年甘肅省規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)JE的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果表明,JE總陽(yáng)性率為15.56%[13],差異較大,可能存在近幾年甘肅省豬JE感染率大幅度上升,亦或檢測(cè)方法靈敏度不同造成,具體尚需試驗(yàn)證明。

仔豬的抗體主要來(lái)源于母乳,而自身免疫系統(tǒng)不健全,自己尚不能分泌,待滿月后,母源抗體水平逐漸下降。待自身也有能力分泌抗體時(shí),一旦接觸到JEV就會(huì)受到感染或免疫接種,才會(huì)產(chǎn)生較高水平的抗體,但具體感染期、抗體水平維持時(shí)間尚不清楚,需進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

通過(guò)本次血清學(xué)調(diào)查,說(shuō)明甘肅省豬群存在較高的JEV感染,且潛在的危害不可忽視,應(yīng)積極采取措施加強(qiáng)防治,尤其是陽(yáng)性率較高的地區(qū)要加強(qiáng)防蚊,滅蚊和免疫接種等工作。本次調(diào)查主要檢測(cè)血清中JE抗體,只能說(shuō)明該豬正在感染或曾經(jīng)感染過(guò),但不能絕對(duì)代表豬群發(fā)病,屬間接調(diào)查了豬感染的情況。尚可以進(jìn)一步對(duì)血清采用 RT-PCR法擴(kuò)增,對(duì)陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序,并對(duì)序列進(jìn)行分析,確定其基因型,可以更好的了解和研究豬感染JEV的規(guī)律和病毒突變、進(jìn)化等,并且可以早期診斷,對(duì)于開(kāi)展日本腦炎的預(yù)防工作具有重要意義。

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