曾 政,米自由,熊仲良,楊澤林,王 健

(1.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心,重慶 401120;2.重慶市農(nóng)業(yè)委員會,重慶 401121)

豬圓環(huán)病毒病和高致病性豬繁殖與呼吸道綜合征是近年影響我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的兩種主要豬病,這兩種病都能損害豬的免疫系統(tǒng),導(dǎo)致豬體質(zhì)下降,引起其他病原體的繼發(fā)感染,造成很高的死亡率和淘汰率[1-3]。2009年5月以來,重慶市部分區(qū)縣發(fā)生了不明原因的豬病疫情,大部分病豬表現(xiàn)為體溫升高,皮膚蒼白,背、臀部皮膚破潰,耳尖壞死,黃疸,便秘或腹瀉,消瘦等臨床癥狀。發(fā)病率在25%～100%之間,病死率不等,部分養(yǎng)殖場生豬全部發(fā)病死亡,由此造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。重慶市動物疫病預(yù)防控制中心從37個發(fā)病豬場采集了組織樣61份,全血19份,血清360份分別進(jìn)行了豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HPPRRSV)、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)的檢測,對豬偽狂犬病毒(PRV)抗體、豬流感(SIV)H1N1抗體、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(App)抗體、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)抗體、弓形蟲(TOX)IgG抗體進(jìn)行檢測,希望能準(zhǔn)確掌握此次引起重慶市豬場生豬發(fā)病的病原情況,為有效防控疫情提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 從長壽區(qū)、萬州區(qū)、合川區(qū)等12個區(qū)縣的37個豬場的瀕死病豬,無菌采集組織樣品(肺、脾及淋巴結(jié))61份,血清360份,編號后-20℃保存,另采集抗凝血19份(來自5個豬場)。所有豬場均注射了CSFV和口蹄疫病毒(FMDV)疫苗,部分豬場注射了HP-PRRSV疫苗。

1.1.2 主要試劑 HP-PRRSV熒光 RT-PCR K it(批號:20090408),PRRSV熒光 RT-PCR K it(批號:20090512),PPV熒光PCR Kit(批號:20090221)和CSFV熒光RT-PCR K it(批號:20090409)均購自深圳太太基因生物有限公司。SIV H 1N1抗體ELISA K it(批號:07731-JB425),App抗體 ELISA Kit(批號:07733-JB416),PRV ELISA K it(09836-EC601)均購自美國IDEXX公司;TGEV ELISA Kit(批號:P04872)購自瑞士Svanova生物技術(shù)公司;Tox IgG抗體Kit(批號:20090506)購自珠海海泰生物制藥有限公司;PCR試劑,DL 2 000 Marker購自寶生物工程(大連)有限公司。病毒/液體樣品DNA/RNA抽提試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為分析純。

1.1.3 引物 PCV-2 PCR檢測引物根據(jù)Genebank發(fā)表的序列(gi:42794975),采用ORF2特異性保守序列設(shè)計,PCV-1:TTTTAAGGGTTAAGTGGGG,PCV-2:ATGACGTATCCAAGGAG,預(yù)期擴(kuò)增片段長度為700 bp。

1.2 方法

1.2.1 DNA/RNA提取 DNA/RNA抽提均按照病毒/液體樣品DNA/RNA抽提試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.2.2 病毒檢測

1.2.2.1 PCV-2目的基因的擴(kuò)增 以提取的PCV-2 DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為94℃變性5min后,94℃45 s,55℃45 s,72℃45 s,循環(huán)30次,72℃延伸10min結(jié)束,PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.2.2.2 HP-PRRSV、PRRSV、CSFV分別用熒光(RT)PCR試劑盒進(jìn)行檢測,同時設(shè)定陰、陽性對照,結(jié)果按照試劑盒說明書判定。

1.2.3 血清抗體檢測 血清樣品抗體檢測均采用ELISA法,具體操作和結(jié)果判定按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 細(xì)菌分離 按照常規(guī)細(xì)菌分離方法進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2.5 附紅細(xì)胞體檢查 將抗凝血用生理鹽水稀釋1倍,滴加約 20μL于載玻片上,姬姆薩染色,相差顯微鏡100倍鏡下觀察。如果紅細(xì)胞形態(tài)完整,邊緣整齊,則為陰性;如果血漿中有圓形、短桿狀折光性較強(qiáng)的蟲體,不停翻轉(zhuǎn),移動,呈淡紅或淡紫紅色,紅細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,變?yōu)槲褰切位蚨噙呅?則判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 病毒檢測結(jié)果

對61份組織進(jìn)行病原學(xué)檢測,從51份樣品中檢出了PCV-2(樣品陽性率83.61%),陽性豬場數(shù)為35個,豬場陽性率為94.59%;從32份樣品中檢測出HP-PRRSV(樣品陽性率52.46%),陽性豬場數(shù)為22個,豬場陽性率為59.46%;從2份樣品中檢測到PRRSV(樣品陽性率1.63%),陽性豬場數(shù)為2個,豬場陽性率為5.41%;所有樣品均未檢測到CSFV(表1)。

表1 樣品病原學(xué)檢測結(jié)果Table1 The results of pathogenic detection of samples collected from different pig farm s

2.2 血清檢測結(jié)果

通過ELISA檢測360份血清,顯示PRV陽性血清41份,陽性豬場12個;TOX陽性血清68份,陽性豬場22個;App陽性血清113份,陽性豬場25個;SIV(H1N1)陽性血清 29份,陽性豬場 9個;TGEV陽性血清13份,陽性豬場3個(表2)。

2.3 細(xì)菌分離結(jié)果

從7份樣品中分離出大腸埃希菌。

2.4 附紅細(xì)胞體檢查結(jié)果

鏡檢表明來自5個豬場的19份全血樣品中有18份為豬附紅細(xì)胞體陽性,樣品陽性率達(dá)94.73%,豬場陽性率為100%。

3 混合感染情況分析

對所有樣品的病原學(xué)和血清學(xué)檢測結(jié)果表明,兩種或兩種以上疫病感染的豬場有35個,占檢測豬場數(shù)的94.59%;以PCV-2+App,PCV-2+HP-PRRSV,PCV-2+TOX混合感染的豬場數(shù)最多,分別占檢測豬場數(shù)的56.75%、51.35%和48.65%,統(tǒng)計結(jié)果見表3。

表2 不同區(qū)縣樣品血清學(xué)檢測結(jié)果Table2 Results of serologicaldiagnosisof serum sam ples collected from differen t pig farms

表3 豬場混合感染情況Table3 Them ixed infection situation in the pig farm s

4 討論

PCV-2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原,它還與許多豬相關(guān)疾病的發(fā)生有重要關(guān)聯(lián),如豬皮炎與腎炎綜合征(PDNS)、增生性壞死性肺炎P(NP)、豬呼吸綜合征(PRDC)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病。PCV-2及其相關(guān)的疾病已在全世界范圍內(nèi)發(fā)生與流行,發(fā)病率最高可達(dá)60%,死亡率5%～20%不等,暴發(fā)時病死淘汰率在40%以上[4],現(xiàn)已被世界各國的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認(rèn)為是繼豬繁殖與呼吸綜合征之后最重要的豬傳染病。研究表明,我國豬群中廣泛存在PCV-2感染。郎洪武等[5]用ELISA檢測來自北京、河北、山東等7省(市)22個豬群中共559份血清,檢出的總陽性率為42.9%。王忠田等[6]用PCR對我國北京、天津、河北等省(市)的12個規(guī)?；i場發(fā)病豬群進(jìn)行PCV-2感染的流行病學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)陽性檢出率為96%。

用于檢測PCV-2的PCR技術(shù)已經(jīng)完全成熟,成為早期快速檢測 PCV-2的重要手段[7-8]。由于ORF2作為PCV-2的主要結(jié)構(gòu)蛋白,其編碼基因與PCV-1的 ORF2核苷酸同源性僅有 67%,所以在PCV-2的ORF2基因序列的保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計引物,能夠準(zhǔn)確檢測出病毒。

本次調(diào)查是在結(jié)合流行病學(xué)、臨床及解剖癥狀的基礎(chǔ)上,從12個區(qū)縣發(fā)病豬場采集了病料。發(fā)病豬場均為中小型豬場,存欄數(shù)在15頭～350頭之間,發(fā)病豬主要集中在20日齡～70日齡(87%),與2007年發(fā)生的HP-PRRS不同的是,許多病豬臨床上并無皮膚紅紫、耳朵發(fā)紺等癥狀,而是出現(xiàn)了生長不良、貧血和黃疸、皮膚病灶、神經(jīng)癥狀、跛行等癥狀,診斷結(jié)果也表明94.59%的豬場均為PCV-2陽性。顯示PCV-2已在重慶市的豬場里廣泛存在,并且其危害性也大為增加。實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果表明,HP-PRRS依然是重慶養(yǎng)豬業(yè)的巨大威脅,59.46%的豬場為陽性,51.35%的豬場為 PCV-2和 HPPRRSV雙重感染,也發(fā)現(xiàn)國外PCV-2和PRRSV共同感染的比例很高[9],在美國高達(dá) 20%～60%,Ohlinger V E等對432個斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)樣品的檢查結(jié)果表明,PCV-2與PRRSV共同感染率高達(dá)75.9%。同時,研究發(fā)現(xiàn),PCV-2與PRRSV共同感染促進(jìn)了PCV-2的增殖,并且豬的病死率明顯超過PCV-2或PRRSV單獨(dú)感染[10]。此次發(fā)病豬場如果是PCV-2單獨(dú)或者和其他病原混合感染,病豬死亡率保持在較低的水平(0%～43%),但是,一旦PCV-2和HP-PRRSV混合感染,則病死率明顯上升(35%～100%),有3個豬場甚至全群發(fā)病,全群死亡。

對5個豬場的19份抗凝血進(jìn)行附紅細(xì)胞體檢測,樣品陽性率為94.73%,有2個豬場的全血樣品幾乎找不到完整的紅細(xì)胞,相應(yīng)的發(fā)病豬的高熱、貧血和黃疸等臨床癥狀也特別嚴(yán)重。近幾年來國內(nèi)越來越多關(guān)于各種動物附紅細(xì)胞體感染率快速增加的報道,而人的附紅細(xì)胞體病例也逐漸增多,嚴(yán)重影響了人類生命健康[11]。附紅細(xì)胞體除了阻礙畜牧業(yè)的發(fā)展,還成為公共衛(wèi)生安全的威脅。附紅細(xì)胞體病目前有合適的治療藥物,因此豬場應(yīng)合理用藥,控制其發(fā)生和傳播。

此次調(diào)查顯示,發(fā)病豬場并無嚴(yán)重的細(xì)菌感染,而以PCV-2、HP-PRRSV、App和 TOX 4種豬病感染最為普遍,其中94.59%的被檢豬場都是混合感染,89.19%的豬場都是3種以上疫病混合感染。究其原因,一方面由于近段時間,生豬價格居高不下,導(dǎo)致許多非業(yè)內(nèi)人士轉(zhuǎn)向養(yǎng)殖業(yè),盲目大規(guī)模的引進(jìn)豬種,但又缺乏相應(yīng)的檢疫、養(yǎng)殖和管理技術(shù);另一方面,初夏雨季氣候炎熱潮濕,也是疫病發(fā)生和傳播的重要誘因。由于PCV-2和HP-PRRSV都沒有有效治療措施,并且都能損害免疫系統(tǒng)引起并發(fā)和繼發(fā)感染,甚至?xí)?dǎo)致免疫失敗。所以,必須重視這兩種疫病的防控工作,加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和日常監(jiān)測,重視消毒工作,謹(jǐn)慎引種,對病豬及時隔離,防止繼發(fā)感染。

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