曾 政,米自由,熊仲良,楊澤林,王 健

(1.重慶市動物疫病預防控制中心,重慶 401120;2.重慶市農業(yè)委員會,重慶 401121)

豬圓環(huán)病毒病和高致病性豬繁殖與呼吸道綜合征是近年影響我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的兩種主要豬病,這兩種病都能損害豬的免疫系統(tǒng),導致豬體質下降,引起其他病原體的繼發(fā)感染,造成很高的死亡率和淘汰率[1-3]。2009年5月以來,重慶市部分區(qū)縣發(fā)生了不明原因的豬病疫情,大部分病豬表現(xiàn)為體溫升高,皮膚蒼白,背、臀部皮膚破潰,耳尖壞死,黃疸,便秘或腹瀉,消瘦等臨床癥狀。發(fā)病率在25%～100%之間,病死率不等,部分養(yǎng)殖場生豬全部發(fā)病死亡,由此造成了巨大的經(jīng)濟損失。重慶市動物疫病預防控制中心從37個發(fā)病豬場采集了組織樣61份,全血19份,血清360份分別進行了豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HPPRRSV)、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬細小病毒(PPV)的檢測,對豬偽狂犬病毒(PRV)抗體、豬流感(SIV)H1N1抗體、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(App)抗體、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)抗體、弓形蟲(TOX)IgG抗體進行檢測,希望能準確掌握此次引起重慶市豬場生豬發(fā)病的病原情況,為有效防控疫情提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 從長壽區(qū)、萬州區(qū)、合川區(qū)等12個區(qū)縣的37個豬場的瀕死病豬,無菌采集組織樣品(肺、脾及淋巴結)61份,血清360份,編號后-20℃保存,另采集抗凝血19份(來自5個豬場)。所有豬場均注射了CSFV和口蹄疫病毒(FMDV)疫苗,部分豬場注射了HP-PRRSV疫苗。

1.1.2 主要試劑 HP-PRRSV熒光 RT-PCR K it(批號:20090408),PRRSV熒光 RT-PCR K it(批號:20090512),PPV熒光PCR Kit(批號:20090221)和CSFV熒光RT-PCR K it(批號:20090409)均購自深圳太太基因生物有限公司。SIV H 1N1抗體ELISA K it(批號:07731-JB425),App抗體 ELISA Kit(批號:07733-JB416),PRV ELISA K it(09836-EC601)均購自美國IDEXX公司;TGEV ELISA Kit(批號:P04872)購自瑞士Svanova生物技術公司;Tox IgG抗體Kit(批號:20090506)購自珠海海泰生物制藥有限公司;PCR試劑,DL 2 000 Marker購自寶生物工程(大連)有限公司。病毒/液體樣品DNA/RNA抽提試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司。其他試劑均為分析純。

1.1.3 引物 PCV-2 PCR檢測引物根據(jù)Genebank發(fā)表的序列(gi:42794975),采用ORF2特異性保守序列設計,PCV-1:TTTTAAGGGTTAAGTGGGG,PCV-2:ATGACGTATCCAAGGAG,預期擴增片段長度為700 bp。

1.2 方法

1.2.1 DNA/RNA提取 DNA/RNA抽提均按照病毒/液體樣品DNA/RNA抽提試劑盒操作說明進行。

1.2.2 病毒檢測

1.2.2.1 PCV-2目的基因的擴增 以提取的PCV-2 DNA為模板進行PCR反應,反應條件為94℃變性5min后,94℃45 s,55℃45 s,72℃45 s,循環(huán)30次,72℃延伸10min結束,PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果。

1.2.2.2 HP-PRRSV、PRRSV、CSFV分別用熒光(RT)PCR試劑盒進行檢測,同時設定陰、陽性對照,結果按照試劑盒說明書判定。

1.2.3 血清抗體檢測 血清樣品抗體檢測均采用ELISA法,具體操作和結果判定按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 細菌分離 按照常規(guī)細菌分離方法進行細菌分離。

1.2.5 附紅細胞體檢查 將抗凝血用生理鹽水稀釋1倍,滴加約 20μL于載玻片上,姬姆薩染色,相差顯微鏡100倍鏡下觀察。如果紅細胞形態(tài)完整,邊緣整齊,則為陰性;如果血漿中有圓形、短桿狀折光性較強的蟲體,不停翻轉,移動,呈淡紅或淡紫紅色,紅細胞形態(tài)不規(guī)則,變?yōu)槲褰切位蚨噙呅?則判為陽性。

2 結果

2.1 病毒檢測結果

對61份組織進行病原學檢測,從51份樣品中檢出了PCV-2(樣品陽性率83.61%),陽性豬場數(shù)為35個,豬場陽性率為94.59%;從32份樣品中檢測出HP-PRRSV(樣品陽性率52.46%),陽性豬場數(shù)為22個,豬場陽性率為59.46%;從2份樣品中檢測到PRRSV(樣品陽性率1.63%),陽性豬場數(shù)為2個,豬場陽性率為5.41%;所有樣品均未檢測到CSFV(表1)。

表1 樣品病原學檢測結果Table1 The results of pathogenic detection of samples collected from different pig farm s

2.2 血清檢測結果

通過ELISA檢測360份血清,顯示PRV陽性血清41份,陽性豬場12個;TOX陽性血清68份,陽性豬場22個;App陽性血清113份,陽性豬場25個;SIV(H1N1)陽性血清 29份,陽性豬場 9個;TGEV陽性血清13份,陽性豬場3個(表2)。

2.3 細菌分離結果

從7份樣品中分離出大腸埃希菌。

2.4 附紅細胞體檢查結果

鏡檢表明來自5個豬場的19份全血樣品中有18份為豬附紅細胞體陽性,樣品陽性率達94.73%,豬場陽性率為100%。

3 混合感染情況分析

對所有樣品的病原學和血清學檢測結果表明,兩種或兩種以上疫病感染的豬場有35個,占檢測豬場數(shù)的94.59%;以PCV-2+App,PCV-2+HP-PRRSV,PCV-2+TOX混合感染的豬場數(shù)最多,分別占檢測豬場數(shù)的56.75%、51.35%和48.65%,統(tǒng)計結果見表3。

表2 不同區(qū)縣樣品血清學檢測結果Table2 Results of serologicaldiagnosisof serum sam ples collected from differen t pig farms

表3 豬場混合感染情況Table3 Them ixed infection situation in the pig farm s

4 討論

PCV-2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原,它還與許多豬相關疾病的發(fā)生有重要關聯(lián),如豬皮炎與腎炎綜合征(PDNS)、增生性壞死性肺炎P(NP)、豬呼吸綜合征(PRDC)、繁殖障礙、先天性顫抖、腸炎等疾病。PCV-2及其相關的疾病已在全世界范圍內發(fā)生與流行,發(fā)病率最高可達60%,死亡率5%～20%不等,暴發(fā)時病死淘汰率在40%以上[4],現(xiàn)已被世界各國的獸醫(yī)與養(yǎng)豬業(yè)者公認為是繼豬繁殖與呼吸綜合征之后最重要的豬傳染病。研究表明,我國豬群中廣泛存在PCV-2感染。郎洪武等[5]用ELISA檢測來自北京、河北、山東等7省(市)22個豬群中共559份血清,檢出的總陽性率為42.9%。王忠田等[6]用PCR對我國北京、天津、河北等省(市)的12個規(guī)模化豬場發(fā)病豬群進行PCV-2感染的流行病學調查,發(fā)現(xiàn)陽性檢出率為96%。

用于檢測PCV-2的PCR技術已經(jīng)完全成熟,成為早期快速檢測 PCV-2的重要手段[7-8]。由于ORF2作為PCV-2的主要結構蛋白,其編碼基因與PCV-1的 ORF2核苷酸同源性僅有 67%,所以在PCV-2的ORF2基因序列的保守區(qū)域內設計引物,能夠準確檢測出病毒。

本次調查是在結合流行病學、臨床及解剖癥狀的基礎上,從12個區(qū)縣發(fā)病豬場采集了病料。發(fā)病豬場均為中小型豬場,存欄數(shù)在15頭～350頭之間,發(fā)病豬主要集中在20日齡～70日齡(87%),與2007年發(fā)生的HP-PRRS不同的是,許多病豬臨床上并無皮膚紅紫、耳朵發(fā)紺等癥狀,而是出現(xiàn)了生長不良、貧血和黃疸、皮膚病灶、神經(jīng)癥狀、跛行等癥狀,診斷結果也表明94.59%的豬場均為PCV-2陽性。顯示PCV-2已在重慶市的豬場里廣泛存在,并且其危害性也大為增加。實驗室診斷結果表明,HP-PRRS依然是重慶養(yǎng)豬業(yè)的巨大威脅,59.46%的豬場為陽性,51.35%的豬場為 PCV-2和 HPPRRSV雙重感染,也發(fā)現(xiàn)國外PCV-2和PRRSV共同感染的比例很高[9],在美國高達 20%～60%,Ohlinger V E等對432個斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)樣品的檢查結果表明,PCV-2與PRRSV共同感染率高達75.9%。同時,研究發(fā)現(xiàn),PCV-2與PRRSV共同感染促進了PCV-2的增殖,并且豬的病死率明顯超過PCV-2或PRRSV單獨感染[10]。此次發(fā)病豬場如果是PCV-2單獨或者和其他病原混合感染,病豬死亡率保持在較低的水平(0%～43%),但是,一旦PCV-2和HP-PRRSV混合感染,則病死率明顯上升(35%～100%),有3個豬場甚至全群發(fā)病,全群死亡。

對5個豬場的19份抗凝血進行附紅細胞體檢測,樣品陽性率為94.73%,有2個豬場的全血樣品幾乎找不到完整的紅細胞,相應的發(fā)病豬的高熱、貧血和黃疸等臨床癥狀也特別嚴重。近幾年來國內越來越多關于各種動物附紅細胞體感染率快速增加的報道,而人的附紅細胞體病例也逐漸增多,嚴重影響了人類生命健康[11]。附紅細胞體除了阻礙畜牧業(yè)的發(fā)展,還成為公共衛(wèi)生安全的威脅。附紅細胞體病目前有合適的治療藥物,因此豬場應合理用藥,控制其發(fā)生和傳播。

此次調查顯示,發(fā)病豬場并無嚴重的細菌感染,而以PCV-2、HP-PRRSV、App和 TOX 4種豬病感染最為普遍,其中94.59%的被檢豬場都是混合感染,89.19%的豬場都是3種以上疫病混合感染。究其原因,一方面由于近段時間,生豬價格居高不下,導致許多非業(yè)內人士轉向養(yǎng)殖業(yè),盲目大規(guī)模的引進豬種,但又缺乏相應的檢疫、養(yǎng)殖和管理技術;另一方面,初夏雨季氣候炎熱潮濕,也是疫病發(fā)生和傳播的重要誘因。由于PCV-2和HP-PRRSV都沒有有效治療措施,并且都能損害免疫系統(tǒng)引起并發(fā)和繼發(fā)感染,甚至會導致免疫失敗。所以,必須重視這兩種疫病的防控工作,加強飼養(yǎng)管理和日常監(jiān)測,重視消毒工作,謹慎引種,對病豬及時隔離,防止繼發(fā)感染。

[1]郎洪武,王 力,張廣川,等.豬圓環(huán)病毒分離鑒定及豬斷奶多系統(tǒng)衰弱綜合征的診斷[J].中國獸醫(yī)科技,2001,31(3):3-5.

[2]Tian K G,Yu X L,Zhao T Z,et al.Emergence of fatalPRRSV variants:unparalleled outbreak sof atypical PRRS in China and m olecu lar dissection of the unique hallmark[J].PLoS one,2007,13(2):e526.

[3]Tong G Z,Zhou Y J,Hao X F,et al.High ly pathogenic porcine reproductive and respirato ry synd rom e[J].Em erg Infect Dis,2007,9(13):1434-1436.

[4]Harm s P A.Post-w eaning multisy stem ic w asting synd romecase studies[D].In:Proceedings of the Seventh Annual Iowa Swine Disease Conference on Sw ine Practitioners,1999:43-47.

[5]郎洪武,張廣川,吳發(fā)權,等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測[J].中國獸醫(yī)科技,2000,30(3):3-5.

[6]王忠田,楊漢春,郭 鑫.規(guī)?；i場PCV 2感染的流行病學調查[J].中國獸醫(yī)雜志,2002,38(10):3-6.

[7]呂艷麗,楊漢春,郭 鑫.用PCR檢測豬圓環(huán)病毒II型[J].中國獸醫(yī)學報,2002,22(6):552-554.

[8]蘆銀華,陳德勝,戴亞斌,等.用復合 PCR檢測豬圓環(huán)病毒[J].中國獸醫(yī)科技,2001,31(9):8-9.

[9]A llan G M,M cNeilly F,Ellis J,et al.Experimental infection of colostrum deprived piglets w ith porcine circovirus 2(PCV 2)and porcine rep rodu ctive and respiratory syndrome virus(PRRSV)poten tiates PCV 2 replication[J].A rch V irol,2000,145(11):2421-2429.

[10]Harms P A,Sorden SD,H albur PG,et al.Experimental rep roduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected w ith type 2 porcine circovirusand porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Vet Pathol,2001,38,528–539.

[11]李 妍,孫成棟.兒童附紅細胞體病 1例[J].實用兒科臨床雜志,2002,17(3):273.