祝偉霞,劉亞風,梁 煒

(河南出入境檢驗檢疫局,河南鄭州 450003)

硝基呋喃類藥物是人工合成的具有5-硝基基本結構的廣譜抗菌藥物[1],是一類具有潛在致癌和誘導有機體產生突變的物質。硝基呋喃類藥物主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮(圖1)[2-3]。硝基呋喃類藥物常用于治療和預防沙門菌、大腸埃希菌感染引起的豬、魚、禽類消化系統(tǒng)感染。該類藥物半衰期很短,在動物體內能迅速代謝[4],與蛋白結合的代謝物能產生穩(wěn)定的殘留,常用的食品烹飪方法如蒸煮、烘烤和微波加熱等均無法使代謝物降解[5]。Chu P S等[6]研究鯰魚口服呋喃類藥物時發(fā)現(xiàn),其代謝物在56 d后檢測還呈陽性。采用同位素標記對呋喃唑酮的毒性進行研究,證明該藥具有致癌和致基因突變性,蛋白結合態(tài)的呋喃唑酮代謝物含有3-氨基-2-唑酮的完整側鏈,在胃液的弱酸條件下,側鏈可以從結合態(tài)的母體分子中解離,水解為具有致癌性的基團β-羥乙基肼[7]。

歐盟2377/90/EEC已全面禁止呋喃類抗菌藥物作為生長劑和殺菌劑用在動物飼料中,歐盟要求以代謝物為目標分析物,檢測硝基呋喃原藥殘留,并要求方法靈敏度要達到1μg/kg[8],同時歐盟1756/2002/EC也禁用了新發(fā)現(xiàn)的呋喃類藥物硝呋索爾。2002年我國出口到歐盟的蝦查出硝基呋喃陽性,歐盟通報所有出口國檢測呋喃類藥物[9],中國、美國、日本也相繼禁止在食用動物中使用呋喃類藥物作為生長劑和殺菌劑,方法檢出限要求達到0.5μg/kg[10]。為了應對“綠色壁壘”的挑戰(zhàn),本文全面綜述了目前硝基呋喃類代謝物殘留檢測的樣品前處理方法、儀器測定方法及呋喃西林假陽性的問題。

1 樣品前處理

1.1 樣品水解和衍生化

硝基呋喃類抗生素在動物體內代謝快,半衰期短。血漿、尿不能用于呋喃類代謝物檢測,一般選用禽肉、雞蛋、肝臟等動物性食品為檢測對象,原藥代謝后以蛋白結合物形態(tài)存在于機體組織中,根據(jù)試驗目的可分為硝基呋喃代謝物總量和結合態(tài)代謝物檢測。Conneely A等[11]測定結合態(tài)呋喃唑酮代謝物時樣品先用甲醇、水、乙醇、乙醚洗滌,以除去游離態(tài)代謝物。結合態(tài)代謝物只有在適當?shù)乃嵝詶l件下才能釋放出來,硝基呋喃檢測中常用稀鹽酸溶液解離結合態(tài)代謝物。4種硝基呋喃代謝物分子質量均在75 g/mol～201 g/mol[12],進行液相色譜串聯(lián)質譜測定時必須進行衍生化,衍生化是為了增加分子質量,使化合物不在高噪音背景下,增加特征碎片離子的選擇性[3],提高質譜響應。常采用2-硝基苯甲醛(2-NBA)衍生化氨基增加代謝物的離子化效率,水解后生成硝基苯衍生物,衍生化一般在37℃過夜進行,親核基團R-NH2酸性催化環(huán)境很快游離出來與2-NBA碳?；l(fā)生化學作用。

M ottier P等[8]在雞肉中添加5μg/kg硝基呋喃代謝物進行衍生化時發(fā)現(xiàn) 1-氨基-2-內酰腺(AHD)和氨基脲(SEM)最穩(wěn)定,而 3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)和 5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)損失40%。Leitner A等[13]等采用不同衍生化試劑對代謝物衍生化效率及穩(wěn)定性進行比較,結果表明,2-NBA是呋喃類代謝物最有效的衍生化試劑,衍生化效率大于70%。李耀平等[14]建立在親核加成反應機理的基礎上,采用新衍生劑2-氯苯甲醛衍生硝基呋喃代謝物,提高了靈敏度,縮短了衍生反應時間。

圖1 4種硝基呋喃原藥、代謝物、衍生物結構式Fig.1 The stuctu res of four nitrofu rans inc luding medicines,m atabolites,derivates

1.2 液液萃取凈化

呋喃類液液萃取一般是在pH 6～7水溶液與乙酸乙酯進行兩相分配[15-16],在液液萃取操作過程中,樣品溶液的pH對萃取效率有很大的影響,丁濤等[17]試驗不同pH對回收率的影響,發(fā)現(xiàn)pH為7～7.5時,AHD、AOZ、SEM 和AMOZ代謝物的衍生產物提取效率最高,分別為92.1%、95.1%、91.4%和94.3%。液液萃取易產生乳化現(xiàn)象,特別對含高蛋白、高脂肪、高淀粉的樣品,需要加入冗長的去乳步驟,延長了試驗操作時間。

1.3 固相萃取凈化

為了更有效地凈化動物源性食品中硝基呋喃類代謝物,常采用陰離子交換混合機理柱(MAX)、聚苯乙烯-二乙烯苯柱(LiChrolut EN)和親水-親脂平衡料固相萃取柱(HLB)凈化樣品[1-2,18],利用pH 7時分子間π-π作用力保留硝基芳香化合物,有機溶劑如乙酸乙酯或甲醇破壞這種作用力而洗脫被測物,Conneely A等[11]分別試驗了溶液pH為3、6和10時H LB小柱凈化時的回收率,數(shù)據(jù)表明pH 6時HLB柱回收率最高。林黎明等[1]評價了 MAX與HLB串聯(lián)柱、LiChrolut EN柱、HLB柱凈化時的回收率,最后得出H LB柱與EN柱獲得相同的回收率。

2 檢測方法

呋喃類結構化合物紫外吸收不明顯,因此在紫外檢測時靈敏度很低,不能滿足代謝物0.5μg/kg限量要求;同時毛細管電泳和薄層色譜因其靈敏度低,在呋喃類代謝物檢測中應用很少[3,19],其代謝物殘留檢測常用液相色譜串聯(lián)質譜法和酶聯(lián)免疫法。

2.1 液質聯(lián)用

液質聯(lián)用技術同時利用了液相色譜較強的分離能力與質譜檢測器豐富的結構信息,為目標化合物提供了可靠的定性和定量結果。由于硝基呋喃類藥物代謝物具有較低的離子化效率并缺少特征離子,2-NBA衍生物增加了相對分子質量,提高了離子化效率。歐盟EEC/657/2002指令規(guī)定對于禁用藥物的質譜確證方法必須達到4個確證點。在串聯(lián)質譜分析時,檢測1個母離子和2個子離子能達到4個確證點的要求。液質聯(lián)用測定呋喃類代謝物液相分離時流動相中常用有機溶劑(甲醇,乙腈)與弱酸(甲酸,乙酸,甲酸銨,乙酸銨)的混合液。正離子時加入酸能促使目標物的離子化,增強檢測靈敏度。目前液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用已用于測定動物組織[1,8,11,13]、牛奶[12]、禽組織[10,16]、雞蛋[5,15]、鯰魚[6]、蜂王漿[17]、蜂蜜[2]等動物性食品基質中硝基呋喃類代謝物殘留量,檢出限在0.1μg/kg～2μg/kg[20]。

2.2 酶聯(lián)免疫

酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種特異性強、靈敏度高的技術,常作為篩選方法用于殘留分析中。該方法能快速、簡單地測定1種硝基呋喃代謝物殘留,靈敏度取決于制備抗體的選擇性。Vass M等[21]采用ELISA快速測定雞蛋中呋喃西林代謝物,樣品經酸衍生化后酶聯(lián)免疫反應,方法EEC/657/2002驗證,檢出限(CCα)0.13 μg/kg,定量限(CCβ)0.3 μg/kg,回收率在77.8%～110%,陽性測定結果與液質比較,表明該方法測定結果準確;Chang C等[22]采用ELISA測定可食性動物組織呋喃唑酮代謝物時以苯甲醛作為衍生化試劑,生成苯AOZ的衍生物進行檢測,回收率55.8%～99.6%。Pim pitak U等[23]采用ELISA測定蝦中AMOZ,檢出限為0.16μg/kg。

3 SEM假陽性問題

近年來,SEM陽性檢出率越來越高,在被檢出的呋喃類陽性結果中47%是SEM陽性,研究發(fā)現(xiàn),SEM的污染來自三種不同渠道[24],即呋喃類獸藥殘留、卡拉膠和偶氮二甲酰胺?？ɡz常用作食品穩(wěn)定劑和稠化劑,是紅海藻中萃取出的一種多聚糖;偶氮二甲酰胺常作為發(fā)泡劑和面粉添加劑用于食品中,SEM也是偶氮二甲酰胺的一種降解產物,2005年歐盟已禁止其作為發(fā)泡劑用于食品。

4 硝基呋喃類藥物檢測存在問題及展望

目前動物性食品中硝基呋喃類藥物檢測存在著樣品前處理繁瑣,試劑用量大,檢測儀器昂貴,SEM

陽性率高等問題。呋喃類檢測的研究重點是在不需要衍生化步驟的情況下,直接檢測其代謝物來減少分析時間和成本。呋喃類藥物殘留研究的另一方向是建立快速ELISA法,但目前商品化試劑盒只有單克隆抗體,若成功開發(fā)出4種呋喃類藥物的抗體檢測試劑盒,則能使硝基呋喃代謝物檢測達到簡便、快速、成本低廉、特異性強的目的。

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