祝偉霞,劉亞風(fēng),梁 煒

(河南出入境檢驗(yàn)檢疫局,河南鄭州 450003)

硝基呋喃類(lèi)藥物是人工合成的具有5-硝基基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物[1],是一類(lèi)具有潛在致癌和誘導(dǎo)有機(jī)體產(chǎn)生突變的物質(zhì)。硝基呋喃類(lèi)藥物主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮(圖1)[2-3]。硝基呋喃類(lèi)藥物常用于治療和預(yù)防沙門(mén)菌、大腸埃希菌感染引起的豬、魚(yú)、禽類(lèi)消化系統(tǒng)感染。該類(lèi)藥物半衰期很短,在動(dòng)物體內(nèi)能迅速代謝[4],與蛋白結(jié)合的代謝物能產(chǎn)生穩(wěn)定的殘留,常用的食品烹飪方法如蒸煮、烘烤和微波加熱等均無(wú)法使代謝物降解[5]。Chu P S等[6]研究鯰魚(yú)口服呋喃類(lèi)藥物時(shí)發(fā)現(xiàn),其代謝物在56 d后檢測(cè)還呈陽(yáng)性。采用同位素標(biāo)記對(duì)呋喃唑酮的毒性進(jìn)行研究,證明該藥具有致癌和致基因突變性,蛋白結(jié)合態(tài)的呋喃唑酮代謝物含有3-氨基-2-唑酮的完整側(cè)鏈,在胃液的弱酸條件下,側(cè)鏈可以從結(jié)合態(tài)的母體分子中解離,水解為具有致癌性的基團(tuán)β-羥乙基肼[7]。

歐盟2377/90/EEC已全面禁止呋喃類(lèi)抗菌藥物作為生長(zhǎng)劑和殺菌劑用在動(dòng)物飼料中,歐盟要求以代謝物為目標(biāo)分析物,檢測(cè)硝基呋喃原藥殘留,并要求方法靈敏度要達(dá)到1μg/kg[8],同時(shí)歐盟1756/2002/EC也禁用了新發(fā)現(xiàn)的呋喃類(lèi)藥物硝呋索爾。2002年我國(guó)出口到歐盟的蝦查出硝基呋喃陽(yáng)性,歐盟通報(bào)所有出口國(guó)檢測(cè)呋喃類(lèi)藥物[9],中國(guó)、美國(guó)、日本也相繼禁止在食用動(dòng)物中使用呋喃類(lèi)藥物作為生長(zhǎng)劑和殺菌劑,方法檢出限要求達(dá)到0.5μg/kg[10]。為了應(yīng)對(duì)“綠色壁壘”的挑戰(zhàn),本文全面綜述了目前硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留檢測(cè)的樣品前處理方法、儀器測(cè)定方法及呋喃西林假陽(yáng)性的問(wèn)題。

1 樣品前處理

1.1 樣品水解和衍生化

硝基呋喃類(lèi)抗生素在動(dòng)物體內(nèi)代謝快,半衰期短。血漿、尿不能用于呋喃類(lèi)代謝物檢測(cè),一般選用禽肉、雞蛋、肝臟等動(dòng)物性食品為檢測(cè)對(duì)象,原藥代謝后以蛋白結(jié)合物形態(tài)存在于機(jī)體組織中,根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康目煞譃橄趸秽x物總量和結(jié)合態(tài)代謝物檢測(cè)。Conneely A等[11]測(cè)定結(jié)合態(tài)呋喃唑酮代謝物時(shí)樣品先用甲醇、水、乙醇、乙醚洗滌,以除去游離態(tài)代謝物。結(jié)合態(tài)代謝物只有在適當(dāng)?shù)乃嵝詶l件下才能釋放出來(lái),硝基呋喃檢測(cè)中常用稀鹽酸溶液解離結(jié)合態(tài)代謝物。4種硝基呋喃代謝物分子質(zhì)量均在75 g/mol～201 g/mol[12],進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定時(shí)必須進(jìn)行衍生化,衍生化是為了增加分子質(zhì)量,使化合物不在高噪音背景下,增加特征碎片離子的選擇性[3],提高質(zhì)譜響應(yīng)。常采用2-硝基苯甲醛(2-NBA)衍生化氨基增加代謝物的離子化效率,水解后生成硝基苯衍生物,衍生化一般在37℃過(guò)夜進(jìn)行,親核基團(tuán)R-NH2酸性催化環(huán)境很快游離出來(lái)與2-NBA碳?；l(fā)生化學(xué)作用。

M ottier P等[8]在雞肉中添加5μg/kg硝基呋喃代謝物進(jìn)行衍生化時(shí)發(fā)現(xiàn) 1-氨基-2-內(nèi)酰腺(AHD)和氨基脲(SEM)最穩(wěn)定,而 3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)和 5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)損失40%。Leitner A等[13]等采用不同衍生化試劑對(duì)代謝物衍生化效率及穩(wěn)定性進(jìn)行比較,結(jié)果表明,2-NBA是呋喃類(lèi)代謝物最有效的衍生化試劑,衍生化效率大于70%。李耀平等[14]建立在親核加成反應(yīng)機(jī)理的基礎(chǔ)上,采用新衍生劑2-氯苯甲醛衍生硝基呋喃代謝物,提高了靈敏度,縮短了衍生反應(yīng)時(shí)間。

圖1 4種硝基呋喃原藥、代謝物、衍生物結(jié)構(gòu)式Fig.1 The stuctu res of four nitrofu rans inc luding medicines,m atabolites,derivates

1.2 液液萃取凈化

呋喃類(lèi)液液萃取一般是在pH 6～7水溶液與乙酸乙酯進(jìn)行兩相分配[15-16],在液液萃取操作過(guò)程中,樣品溶液的pH對(duì)萃取效率有很大的影響,丁濤等[17]試驗(yàn)不同pH對(duì)回收率的影響,發(fā)現(xiàn)pH為7～7.5時(shí),AHD、AOZ、SEM 和AMOZ代謝物的衍生產(chǎn)物提取效率最高,分別為92.1%、95.1%、91.4%和94.3%。液液萃取易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象,特別對(duì)含高蛋白、高脂肪、高淀粉的樣品,需要加入冗長(zhǎng)的去乳步驟,延長(zhǎng)了試驗(yàn)操作時(shí)間。

1.3 固相萃取凈化

為了更有效地凈化動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類(lèi)代謝物,常采用陰離子交換混合機(jī)理柱(MAX)、聚苯乙烯-二乙烯苯柱(LiChrolut EN)和親水-親脂平衡料固相萃取柱(HLB)凈化樣品[1-2,18],利用pH 7時(shí)分子間π-π作用力保留硝基芳香化合物,有機(jī)溶劑如乙酸乙酯或甲醇破壞這種作用力而洗脫被測(cè)物,Conneely A等[11]分別試驗(yàn)了溶液pH為3、6和10時(shí)H LB小柱凈化時(shí)的回收率,數(shù)據(jù)表明pH 6時(shí)HLB柱回收率最高。林黎明等[1]評(píng)價(jià)了 MAX與HLB串聯(lián)柱、LiChrolut EN柱、HLB柱凈化時(shí)的回收率,最后得出H LB柱與EN柱獲得相同的回收率。

2 檢測(cè)方法

呋喃類(lèi)結(jié)構(gòu)化合物紫外吸收不明顯,因此在紫外檢測(cè)時(shí)靈敏度很低,不能滿(mǎn)足代謝物0.5μg/kg限量要求;同時(shí)毛細(xì)管電泳和薄層色譜因其靈敏度低,在呋喃類(lèi)代謝物檢測(cè)中應(yīng)用很少[3,19],其代謝物殘留檢測(cè)常用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫法。

2.1 液質(zhì)聯(lián)用

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時(shí)利用了液相色譜較強(qiáng)的分離能力與質(zhì)譜檢測(cè)器豐富的結(jié)構(gòu)信息,為目標(biāo)化合物提供了可靠的定性和定量結(jié)果。由于硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物具有較低的離子化效率并缺少特征離子,2-NBA衍生物增加了相對(duì)分子質(zhì)量,提高了離子化效率。歐盟EEC/657/2002指令規(guī)定對(duì)于禁用藥物的質(zhì)譜確證方法必須達(dá)到4個(gè)確證點(diǎn)。在串聯(lián)質(zhì)譜分析時(shí),檢測(cè)1個(gè)母離子和2個(gè)子離子能達(dá)到4個(gè)確證點(diǎn)的要求。液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定呋喃類(lèi)代謝物液相分離時(shí)流動(dòng)相中常用有機(jī)溶劑(甲醇,乙腈)與弱酸(甲酸,乙酸,甲酸銨,乙酸銨)的混合液。正離子時(shí)加入酸能促使目標(biāo)物的離子化,增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度。目前液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用已用于測(cè)定動(dòng)物組織[1,8,11,13]、牛奶[12]、禽組織[10,16]、雞蛋[5,15]、鯰魚(yú)[6]、蜂王漿[17]、蜂蜜[2]等動(dòng)物性食品基質(zhì)中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量,檢出限在0.1μg/kg～2μg/kg[20]。

2.2 酶聯(lián)免疫

酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的技術(shù),常作為篩選方法用于殘留分析中。該方法能快速、簡(jiǎn)單地測(cè)定1種硝基呋喃代謝物殘留,靈敏度取決于制備抗體的選擇性。Vass M等[21]采用ELISA快速測(cè)定雞蛋中呋喃西林代謝物,樣品經(jīng)酸衍生化后酶聯(lián)免疫反應(yīng),方法EEC/657/2002驗(yàn)證,檢出限(CCα)0.13 μg/kg,定量限(CCβ)0.3 μg/kg,回收率在77.8%～110%,陽(yáng)性測(cè)定結(jié)果與液質(zhì)比較,表明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確;Chang C等[22]采用ELISA測(cè)定可食性動(dòng)物組織呋喃唑酮代謝物時(shí)以苯甲醛作為衍生化試劑,生成苯AOZ的衍生物進(jìn)行檢測(cè),回收率55.8%～99.6%。Pim pitak U等[23]采用ELISA測(cè)定蝦中AMOZ,檢出限為0.16μg/kg。

3 SEM假陽(yáng)性問(wèn)題

近年來(lái),SEM陽(yáng)性檢出率越來(lái)越高,在被檢出的呋喃類(lèi)陽(yáng)性結(jié)果中47%是SEM陽(yáng)性,研究發(fā)現(xiàn),SEM的污染來(lái)自三種不同渠道[24],即呋喃類(lèi)獸藥殘留、卡拉膠和偶氮二甲酰胺?？ɡz常用作食品穩(wěn)定劑和稠化劑,是紅海藻中萃取出的一種多聚糖;偶氮二甲酰胺常作為發(fā)泡劑和面粉添加劑用于食品中,SEM也是偶氮二甲酰胺的一種降解產(chǎn)物,2005年歐盟已禁止其作為發(fā)泡劑用于食品。

4 硝基呋喃類(lèi)藥物檢測(cè)存在問(wèn)題及展望

目前動(dòng)物性食品中硝基呋喃類(lèi)藥物檢測(cè)存在著樣品前處理繁瑣,試劑用量大,檢測(cè)儀器昂貴,SEM

陽(yáng)性率高等問(wèn)題。呋喃類(lèi)檢測(cè)的研究重點(diǎn)是在不需要衍生化步驟的情況下,直接檢測(cè)其代謝物來(lái)減少分析時(shí)間和成本。呋喃類(lèi)藥物殘留研究的另一方向是建立快速ELISA法,但目前商品化試劑盒只有單克隆抗體,若成功開(kāi)發(fā)出4種呋喃類(lèi)藥物的抗體檢測(cè)試劑盒,則能使硝基呋喃代謝物檢測(cè)達(dá)到簡(jiǎn)便、快速、成本低廉、特異性強(qiáng)的目的。

[1]林黎明,林回春,劉心同,等.固相萃取高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物組織中硝基呋喃代謝產(chǎn)物[J].分析化學(xué),2005,33(5):707-710.

[2]Lopez M I,Feldlaufer M F,W illiams A D,et al.Determination and confirmation of nitrofuran residues in honey using LC-MS/MS[J].JAgric Food Chem,2007,55:1103-1108.

[3]Wickramanayake P U,T ran T C,H ughes JG.Simultaneous separation of nitrofu ran antibiotics and their metabolites by using m icellar electrokinetic capillary chromatography[J].E-lectrophoresis,2006,27:4069-4077.

[4]蔣 原,丁 濤,徐錦忠.硝基呋喃類(lèi)藥物在克氏螯蝦組織中消除規(guī)律的研究[J].畜牧與獸醫(yī),2008,40(2):34-37.

[5]Finzi JK,Donato JL,Sucupira M,et al.Determination of nitrofuran metabolites in poultry musc le and eggs by liquid ch romatography-tandem mass spectrom etry[J].JChromatog r B,2005,824:30-35.

[6]Chu P S,Lopez M I,Abraham A,et al.Residue depletion of nitrofuran drugs and their thissue-boundmetabolites in channel catfish after oral dosing[J].J Agric Food Chem,2008,56:8030-8034.

[7]Barbosa J,Ferreira mL,Ramos F,et al.Determination of the furaltadone metabolite 5-methy lmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone(AMOZ)using liquid ch romatography coupled to electrosp ray tandem m ass spectrom etry during the nitrofuran crisis in Portugal[J].Accred Qual Assur,2007,12:543-551.

[8]M ottier P,Khong SP,Gremaud E,et al.Quantitative determination of fou r nitrofuranm etabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography-electrospray ionisation-tandem mass spectrometry[J].JChromatog r A,2005,1067:85-91.

[9]H oenicke K,Gatermann R.H ow can zero toleran ces be controlled the case study of nitrofu rans[J].Accred Qual Assu r,2006,11:29-32.

[10]Verdon E,Couedor P,Sanders P.M ulti-residuem onitoring for the simultaneous determination of five nitrofu rans(fu razolidone,furaltadone,nitrofurazone,nitrofurantoine,nifu rsol)in poultry muscle tissue through the detection of their fivemajor metabolites(AOZ,AMOZ,SEM,AHD,DNSAH)by liquid chromatog raphy coupled to electrospray tandem mass spectrom etry-in-house validation in line w ith Comm ission Decision 657/2002/EC[J].Anal Chim Acta,2007,586:336-347.

[11]Conneely A,Nugent A,Keeffe M,et al.Isolation of bound residues of nitrofu ran drugs from tissue by solid-phase extraction w ith determination by liquid ch romatography w ith UV and tandem mass spectrom etric detection[J].Anal Chim Acta 2003,483:91-98.

[12]Rodziewicz L.Determination of nitrofu ran metabolites in m ilk by liquid ch romatography-electrosp ray ionization tandem mass spectrom etry[J].JChromatogr B,2008,864:156-160.

[13]Leitner A,Zollner P,Lindner W.Determination of the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high-performance liquid ch rom atography-tandem mass spectrometry[J].JCh rom atogr A,2001,939:49-58.

[14]李耀平,林永輝,賈東芬,等.水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留快速檢測(cè)新方法的研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2008,27(7):712-717.

[15]Bock C,Stachel C,Gowik P.Validation of a confirmatory m ethod for the determination of residuesof fou r nitrofurans in egg by liquid chromatography-tandem mass spectrometry w ith the softw are Inter Val[J].Anal Chim Acta,2007,586:348-358.

[16]Bock C,Gowik P,Stachel C.M atrix-comprehensive in-house validation and robustness check of a confirmatory method for the determination of fou r nitrofuran metabolites in pou ltry m uscle and shrim p by LC-MS/MS[J].J Ch rom atogr B,2007,856:178-189.

[17]丁 濤,徐錦忠,沈崇鈺,等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定蜂王漿中的四種硝基呋喃類(lèi)藥物的代謝物[J].色譜,2006,24(5):432-435.

[18]Xia X,LiXW,Zhang SX,etal.Simultaneousdetermination of 5-nitroim idazoles and nitrofu rans in pork by high-performance liquid chromatog raphy-tandem m ass spectrometry[J].J Chromatogr A,2008,1208:101-108.

[19]Berezkin V G,Onu chak L A,Evtyugina E N.Capillary thinlayer chroam tog raphy of antibacterial nitrofu ran derivates[J].Russian JAppli Chem,2009,82(2):312-316.

[20]祝偉霞,楊冀州,魏 蔚,等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2008(1):47-50.

[21]Vass M,Dib likova I,Kok E,et al.In-house validation of an ELISA method for screening of sem icarbazide in eggs[J].Food Addi Conta,2008,25(8):930-936.

[22]Chang C,Peng D P,Wu JE,et al.Development of an indirect competitive ELISA for the detection of fu razolidone marker residue in anim aledible tissues[J].JAg ric Food Chem,2007,56:1525-1531.

[23]Pim pitak U,Putong S,Komolpis K.Developmen t of am onoc lonal antibody-based enzym e-linked immunosorben t assay for detection of the fu raltadone metabolite,AMOZ,in fortified shrimp samples[J].Food Chem,2009,116:785-791.

[24]Szilagyi S,Calle B.Developm ent and validation of an analyticalmethod for the determination of sem icarbazide in fresh egg and in egg powder based on the use of liquid chromatography tandem m ass spectrometry[J].Anal Chim Acta,2006,572:113-120.