聞曉波,李冬野,李樹(shù)東,冉旭華,李曉娟,邵 磊,王 密,樸范澤,楊煥民,侯喜林,倪宏波

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)學(xué)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江大慶 163319)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的、危害養(yǎng)豬業(yè)較嚴(yán)重的病毒之一,該病毒與豬的多種疾病綜合征密切相關(guān),包括豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multi-systemic wasting syndrome,PMWS)和母豬的繁殖障礙(Sow abortion and m ortality synd rome,SAMS)等[1-2]。病原學(xué)及血液學(xué)調(diào)查表明該病毒在世界各地廣泛存在,嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[3]。PCV-2基因組全長(zhǎng)1 767 bp或1 768 bp,共包含11個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF),其中ORF1、ORF2是兩個(gè)最大的開(kāi)放閱讀框,分別編碼復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep蛋白)和衣殼蛋白(Cap蛋白)。Cap蛋白是主要的結(jié)構(gòu)蛋白,研究表明其N(xiāo)端含有一個(gè)由41個(gè)氨基酸殘基組成的核定位信號(hào)(NLS),且含有大量的大腸埃希菌稀有密碼子,這將嚴(yán)重影響外源蛋白的表達(dá)[4-6]。本研究利用DNA重組技術(shù)將去除N LS的ORF2(dNLS-ORF2)與ORF1基因串聯(lián)克隆到表達(dá)載體pET30a(+)上,成功構(gòu)建了pET30a-ORF2/ORF 1串聯(lián)基因原核表達(dá)載體,并在大腸埃希菌中獲得高效表達(dá),對(duì)該融合蛋白進(jìn)行初步的免疫學(xué)研究表明,具有較好的免疫學(xué)活性。本研究旨在探討原核表達(dá)ORF2/ORF 1融合蛋白的抗原性及其作為基因工程亞單位疫苗的可能性,為PCV-2基因工程亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 pET30a(+)載體購(gòu)自Novagen公司,TG1、BL21(DE3)pLysS菌株為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,pMD-18T/PCV-2大慶分離株質(zhì)粒由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑、抗體及血清 r Taq DNA聚合酶、DNA M arker(DL 2 000)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、SacⅠ、SalⅠ、XhoⅠ和Prestained M arker購(gòu)自Fermentas公司;柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司;IgG-HRP(goat anti-sw ine)、IgG-HRP(goat anti-mouse)購(gòu)自Jackson公司,PCV-2陽(yáng)性、陰性血清均為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)已知PCV-2序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,引物序列如下(酶切位點(diǎn)下劃線)ATTTATTTCATATGGAAATTCAG-3′(XhoⅠ)。

1.2.2 ORF1與dN LS-ORF2基因的擴(kuò)增 以構(gòu)建好的pMD-18T/PCV-2大慶分離株質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),ORF1基因PCR反應(yīng)條件如下:95℃5min;94℃50 s,50℃50 s,72℃60 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。dNLS-ORF2基因PCR反應(yīng)條件如下:95℃5 min;94℃45 s,55℃30 s,72℃40 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將dNLS-ORF2基因片段和pET-30a(+)載體分別用Bam HⅠ、SacⅠ雙酶切,回收酶切產(chǎn)物,T4 DNA連接酶連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌 TG1感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽(yáng)性克隆,再與ORF1 PCR產(chǎn)物同時(shí)用Sa lⅠ、XhoⅠ雙酶切,回收酶切產(chǎn)物,連接,轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)pLysS,篩選出的陽(yáng)性克隆命名為pET30a-ORF2/ORF1,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.4 重組蛋白的表達(dá)及可溶性分析 將含陽(yáng)性重組質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)物于37℃培養(yǎng),當(dāng)OD600nm=0.6～ 0.8 時(shí),加入 IPTG(終濃度 1.0 mmol/L),于4、5、6 h 取樣 ,進(jìn)行SDS-PAGE,選擇最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。誘導(dǎo)10 mL菌液,離心經(jīng)超聲波裂解,分別取上清及沉淀,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,對(duì)重組蛋白進(jìn)行可溶性分析。

1.2.5 小鼠抗血清的制備 經(jīng)電洗脫法純化重組蛋白[7],加入等體積弗氏完全佐劑乳化,皮下注射于6周齡小鼠,50μg/只,2周后加強(qiáng)免疫,于4周尾部采血制備抗血請(qǐng)。

1.2.6 Western blot分析 經(jīng)SDS-PAGE電泳后,電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用50 g/L脫脂乳PBST(含0.5 mL/L Tween 20)4℃封閉過(guò)夜,PBST洗滌3次,加入PCV-2陽(yáng)性血清(1∶50)或該重組蛋白免疫的小鼠血清(1∶100),37℃孵育1 h,再加入羊抗豬IgG-HRP(1∶2 000)或羊抗小鼠 IgG-HRP(1∶5 000),37℃孵育1 h,PBST洗滌3次,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)-H 2O2顯色,去離子水終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 dNLS-ORF2與ORF1基因擴(kuò)增結(jié)果

去除核定位信號(hào)的ORF2基因片段大小為576 bp,全長(zhǎng) ORF1基因片段大小為 945 bp,經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致(圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR product

2.2 重組質(zhì)粒pET30a-ORF2/ORF1構(gòu)建

重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定得到長(zhǎng)約1 530 bp大小片段,與預(yù)期大小相符。通過(guò)Bam HⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定,也切出了預(yù)期大小目的片段,表明ORF2/ORF1串聯(lián)基因成功地插入了表達(dá)載體中(圖2)。通過(guò)序列測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)目的基因與表達(dá)載體按正確的讀碼框連接。

圖2 重組質(zhì)粒pET30a-ORF2/ORF1的酶切鑒定Fig.2 Iden tification of recombinant plasm idsby ezyme digestion

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6 h后重組蛋白表達(dá)量最大,重組質(zhì)粒pET30a-ORF2/ORF1陽(yáng)性菌在64 ku處出現(xiàn)特異帶,和預(yù)期大小相符,重組蛋白以包涵體形式表達(dá)(圖3)。

2.4 Western blot分析

純化后的重組蛋白與PCV-2陽(yáng)性血清和免疫小鼠血清發(fā)生特異性反應(yīng),顯色后出現(xiàn)單一且清晰的條帶(圖4),證明該重組蛋白具有免疫活性。

圖3 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinan t protein

圖4 W estern blot結(jié)果Fig.4 Western b lot analy sis result

3 討論

PCV-2可引起豬多種疾病,目前已遍布全球。在我國(guó)大部分省市也呈流行趨勢(shì),目前對(duì)預(yù)防和控制PCV-2感染的研究已成熱門(mén)課題。研制安全性好、保護(hù)性高的疫苗已刻不容緩。

利用滅活的PCV-2免疫小鼠和豬體后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,并能夠在一定程度上抵抗PCV-2對(duì)豬體的感染[8]。但是PCV-2增殖的細(xì)胞譜很窄,不能引起明顯的細(xì)胞病變,且增殖的滴度較低,不易于大規(guī)模培養(yǎng)純化,因此發(fā)展傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗難度很大。反之,應(yīng)用基因工程方法利用原核表達(dá)系統(tǒng)研制基因重組亞單位疫苗具有安全性高、大規(guī)模生產(chǎn)純化簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì),在疾病預(yù)防控制方面發(fā)揮越來(lái)越大的作用。Kam strup S等[9]利用基因槍將DNA疫苗免疫小鼠,結(jié)果表明該疫苗可以刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體,顯示有一定的應(yīng)用前景?，F(xiàn)有的報(bào)道均表明,ORF1和ORF2基因是構(gòu)建重組疫苗和臨床檢測(cè)的首選基因[10]。ORF1基因編碼的Rep蛋白包含抗原表位,ORF2基因編碼的衣殼蛋白的 65～87、113～147、157～183氨基酸區(qū)域是主要的抗原結(jié)構(gòu)區(qū)域,但ORF2 N端的核定位信號(hào)和稀有密碼子嚴(yán)重影響ORF2蛋白的原核表達(dá)。本研究克隆ORF2 C端576 bp的基因片段與ORF1基因,利用的酶切位點(diǎn)依次克隆入表達(dá)載體,成功表達(dá)了dnls-ORF2/ORF1融合蛋白,其大小約為64 ku,以包涵體形式存在,具有更好的免疫活性。

本研究應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng),高效、大量表達(dá)PCV-2 ORF2/ORF 1融合蛋白,純化后的重組蛋白不僅能與PCV-2的陽(yáng)性血清反應(yīng)還能刺激小鼠產(chǎn)生特異性的抗體,說(shuō)明該蛋白具有較好的免疫原性與反應(yīng)原性。該研究為進(jìn)一步研制PCV-2基因工程疫苗打下了基礎(chǔ)。

[1]Harms PA,H albur P G,Sorden SD.Th ree cases of porcine respiratory disease complex associated w ith porcine circovirus type 2 infection[J].Swine Health Prod,2002,10(1):27-30.

[2]Hamel A L,Lin L L,NayarG P,et al.Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs[J].JVirol,1998,72(6):526-527.

[3]Shibahara T,Sato K,Ishikaw a Y,et al.Porcine circovirus induces B lymphocy te depletion in pigsw asting disease syndrome[J].Vet Med,2000,62(11):1125-1131.

[4]T rundova M,Celer V.Expression of porcine circovirus2ORF2 gene requires codon optim ized E.coli cells[J].V irus Genes,2007,34(2):199-204.

[5]Liu Q,Tikoo S K,Babiuk L A.Nuc lear localization of the ORF2 p rotein encoded by porcine circovirus type 2[J].V irology,2001,285(1):91-98.

[6]Liu Q,Willson P,A ttoh P S,et al.Bacerial exp ression of an immunologically reactive PCV-2ORF2 fusion portein[J].Protein Expr Pu ri,2001,21(1):115-120.

[7]Li B,Wu H Y,Qian X P,et al.Expression,pu rification and serological analy sis of hepatocellular carcinom a associated antigen HCA 587 in insect cells[J].W orld JGastroenterol,2003,9(4):678-682.

[8]董信田,李玉峰,姜 平,等.豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的制備與免疫效力研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2008,39(5):639-644.

[9]Kamstrup S,Barfoed A M,Frimann T H,et al.Immunisation against PCV 2 stru ctural protein by DNA vaccination of m ice[J].Vaccine,2004,22(11-12):1358-1361.

[10]M ah D,Blanchard P,Truong C,et al.Differential recognition of ORF2 p rotein from type 1 and ty pe 2 porcine circoviruses and iden tification of immunorelevant epitopes[J].JGen.V irol,2000,81(7):1815-1824.