楊 芳, 黃 峙, 郭振江, 鄭文杰
(暨南大學 生命科學技術學院1. 化學系, 2. 生物工程學系, 廣東 廣州 510632)
Se(IV)對藻藍蛋白分子的氧化及納米Se(0)的生成
楊 芳1, 黃 峙2, 郭振江1, 鄭文杰1
(暨南大學 生命科學技術學院1. 化學系, 2. 生物工程學系, 廣東 廣州 510632)
從鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)中提取純化藻藍蛋白(Phycocyanin, PC), 光吸收值A620/A280為3.1, 觀察Se(Ⅳ)與PC相互作用的光譜行為及紅硒化現象。光譜檢測發(fā)現, 加入SeO32-后, PC在620 nm的特征光吸收減弱, 并隨Se(Ⅳ)濃度增加和時間延長單調降低, 278 nm和347 nm的光吸收增強; PC的熒光發(fā)射和熒光激發(fā)也均呈現衰減。另外, PC與 Na2SeO3相互作用后, 觀察到紅硒化現象, 透射電鏡(TEM)證明主要存在形態(tài)為紅色納米硒。結果提示PC可能是SeO32?作用的敏感靶點, Se(Ⅳ)對PC主要表現為氧化損傷, 而Se(Ⅳ)被還原為紅色納米硒。
硒; 鈍頂螺旋藻; 藻藍蛋白; 光譜; 納米
藻藍蛋白(phycocyanin, PC)是藻膽體的主要捕光色素蛋白, 也是目前發(fā)現的最高效的捕光色素蛋白之一[1]。大量研究表明, PC是亞硫酸鹽[2]、UV-B[3]、鹽脅迫[4]及重金屬[5]對藻細胞損傷的主要靶分子。PC損傷主要表現為氧化作用并導致能量傳遞受阻, 光譜學分析是研究 PC功能狀態(tài)及光能傳遞的主要手段之一。
硒對螺旋藻具有低濃度生長促進和高濃度毒性雙重效應[6]。一方面, 螺旋藻作為硒的生物有機化載體, 可以富集和轉化硒, 其中有機硒主要與蛋白質結合, 已發(fā)現硒藻藍蛋白含硒量可達267 μg/g, 動物實驗發(fā)現富硒 PC對小鼠肝氧化損傷有明顯的保護作用[7]。Cases等也報道[8], 富硒螺旋藻提取物中, >30 ku的含硒組分生物活性最高, 而其中主要成分為藻藍蛋白, 說明PC是結合硒的主要效應分子。另一方面,微生物通過一系列氧化還原反應, 實現 Se(0)、Se(Ⅱ)、Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)不同價態(tài)的轉換, 在細菌Rhodospirillum rubrum中紅色Se(0)的產生是緩解硒毒的一種主要方式[9]。但迄今為止, 微藻拮抗硒毒性的機制和分子靶點還不明確。作者利用純化的PC在體外與Se(IV)相互作用, 發(fā)現PC氧化損傷的光譜行為改變, 并伴隨納米紅色Se(0)微粒的形成。
1.1 鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)
鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis) 藻種取自暨南大學水生物研究所, 實驗室保種。采用Zarrouk標準培養(yǎng)基培養(yǎng), 2 000 mL三角瓶中, 加入500 mL培養(yǎng)液, 取對數生長期(第4天)的藻細胞接種并調節(jié)初始A560=0.10, 置于無菌光照培養(yǎng)室中, 光強度5 000 lx左右, 光照時間24 h/d, 溫度30℃±1℃, pH 8.5, 通氣培養(yǎng), 每天添加適量蒸餾水以補充水分蒸發(fā), 第 9天采收。
1.2 藻藍蛋白的提取純化
參照文獻方法[10], 簡言之, 取干藻粉2.0 g懸浮于 30 mL 50 mmol/L的 NaH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH7.0)中, 冰浴中超聲波破碎(工作30 min, 間隔10 min, 電壓120 V, 10個循環(huán)), 4℃條件下5 000 r/min離心15 min, 上清液依次用25%、45%飽和度硫酸銨沉淀, 將沉淀蛋白用少量緩沖液溶解, 超濾濃縮并脫鹽后上 DEAE-52纖維素柱(60 cm×2.5 cm)層析,分部收集, 提取純化后PC光吸收值A620/A280為3.1,PC吸收光譜測定結果(圖 1)表明含少量別藻藍蛋白(Allophycocyanin, APC)。
1.3 藻藍蛋白與Se(IV)作用
把上述所得的藻藍蛋白裝入透析袋(截留分子量:8~10 ku)中, 4℃下, 用 50 mmol/L 的 NaH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH7.0)透析2 d。藻藍蛋白的濃度按(αβ)單體的摩爾濃度計量, (αβ)單體分子質量為35 ku[11], 藻藍蛋白濃度以下列公式[12]計算:
A615、A650、A750分別為 615、650、750nm 處的吸光度。
測定吸收光譜的藻藍蛋白溶液濃度為3.5 μmol/L,以 Se(IV)與藻藍蛋白摩爾比(R)為 0.1、1、10、100確定 Se(IV)溶液的加入量。熒光光譜的藻藍蛋白濃度為 0.11 μmol/L, 同樣以 Se(IV)與藻藍蛋白摩爾比(R)為1、10、100、1000。上述溶液均用50 mmol/L的 NaH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH7.0)配制。25℃下, 避光、密封保存。光譜測定在室溫下進行。
1.4 紅色納米硒的電鏡觀察
將PC與Se(IV)作用一定時間(觀察到有紅色Se的實驗組)所得的紅色硒蛋白溶膠涂在附有碳膜的銅網上, 迅速干燥后用透射電子顯微鏡觀察粒子形狀、分散情況。
1.5 儀器
JY92-II型超聲波細胞破碎機; UV-1100型紫外/可見光度計; 970CRT熒光分光光度計(上海三科儀器總廠); TECNAI 10(PHILIPS)透射電子顯微鏡。
PC 含有α和β亞基, 發(fā)色團(PCB)位于α亞基的半胱氨酸殘基(cysteine, Cys) Cys84 (λmax: 580~590 nm)和β亞基的 Cys84、Cys155(λmax: 615~620 nm)[13],599 nm的激發(fā)峰屬于α亞基的PCB, 629 nm的激發(fā)峰屬于β亞基的PCB。純化的PC具有典型的光譜特性(圖1), 特征吸收峰位于620 nm; 650 nm處的肩峰提示含少量 APC, 但不影響本研究的實驗觀察。熒光光譜(圖2)顯示1個熒光發(fā)射峰(657 nm)和2個熒光激發(fā)峰(599、629 nm)。螺旋藻PCB均結合于Cys殘基, 可能是硒氧化損傷的敏感位點。
2.1 Se(IV)對PC吸收光譜影響
圖1 Se(IV)與PC相互作用的吸收光譜 (R= Se(IV):PC, 摩爾比)Fig. 1 Absorption spectra of interaction between Se(IV) and PC (R= Se(IV):PC, molar ratio)
如圖1所示, 隨Se(IV)濃度增加和作用時間延長,PC 620 nm的吸光度單調降低, 而278 nm和347 nm的吸光度增強, 并與 620 nm光吸收的變化趨勢相反。Se(IV)對PC的損傷可能涉及破壞氫鍵、氧化作用、靜電作用等, 影響蛋白質空間構象與功能。實驗中低R[Se(IV)對PC的摩爾比]即引起PC吸收光譜的明顯變化, 但對樣品中650 nm肩峰(樣品中存在少量別藻藍蛋白)影響不大, 鑒于藻藍蛋白和別藻藍蛋白的性質和結構相似性, 推測 Na2SeO3的電解質效應對PC的損傷不是主要因素。有報道[14]藻藍蛋白是Cu2+等重金屬離子的作用靶分子, Cu2+等重金屬離子帶正電荷, 通過強配位中心體影響帶負電荷以及有配位功能的基團。本實驗觀察到Se(IV)對PC光譜的影響與 Cu2+離子相似, 表現出 620 nm吸光度減弱,可能是 SeO32?帶負電荷且具有較強的氧化性, 可攻擊藻藍蛋白分子中帶正電和不帶電荷或具有還原性的氨基酸側鏈, 如 Cys殘基中的-SH, 引起 PC構象松散, “暴露”PC分子中一部分“埋藏”的酪氨酸或色氨酸殘基, 導致 278 nm光吸收增強。同時,Se(IV)可能通過氧化損傷作用對PCB活性產生影響,從而使620 nm的吸收減弱。PC分子的結構是保證藻藍蛋白內 PCB正常光譜性質的前提[15], 所以, 光譜分析結果可為環(huán)境與微藻應答的敏感性之間關系的研究提供線索。
2.2 Se(IV)對PC熒光光譜影響
圖2表明, 隨Se(IV)濃度的增加, PC熒光發(fā)射和激發(fā)強度均逐漸減弱, 但峰位置均無明顯的改變。Se(IV)對PC的2個熒光激發(fā)峰的影響程度不同,如圖2a所示, 在R值為1時, 599 nm激發(fā)峰強度即開始減弱, 629 nm處激發(fā)峰的強度基本不變, 隨著R值的增大, 2個激發(fā)峰強度雖然均有所減弱, 但599 nm比629 nm相對熒光強度的減弱更為明顯。表明Se(IV)對α和β亞基上PCB發(fā)色團均有作用, 但有差異。
圖2 Se(IV)與PC相互作用的熒光光譜Fig. 2 Fluorescence spectra of interaction between Se(IV) and PC
藻藍蛋白在可見光區(qū)有特征吸收峰, 并具有較強的熒光。這種特性是螺旋藻中藻藍蛋白吸收和轉化光能的基礎。Se(IV)與PC作用后, PC在可見光區(qū)的光吸收和熒光強度都減弱, 說明PC是Se(IV)的靶分子, 直接使PC分子產生損傷。這種作用的結果會導致藻在生長過程中對光能的吸收減少, 光能傳遞受阻, 從而抑制光合作用過程。從 PC和 APC對Se(IV)的不同敏感程度來看, Se(IV)對藻的捕光系統(tǒng)影響主要是作用在PC上。
圖3 PC還原Se(IV)生成的Se(0)納米粒子的TEM形貌Fig. 3 TEM morphology of nano-Se(0) reduced from Se(IV) by PC
2.3 藻藍蛋白對Se(IV)的紅硒化
Se(IV)與 PC作用 92 h 后, 觀察到R>1實驗組出現紅硒化, 提示Se(IV)對PC結構與功能產生影響的同時, PC中的某些基團把Se(IV)還原為Se(0)。PC與 Se(IV)作用 240 h 后得到的紅色硒溶膠中粒子的TEM照片(圖3), 粒徑為3~160 nm。推測其形成的大致過程如下: 首先 Se(IV)被還原并形成直徑一般<30 nm的硒粒子(圖3a, 3b), 由于其表面能很高, 易進一步團聚, 同時硒原子有空的4 d軌道, 是親電子粒子,可作為配位體接受蛋白質側鏈上帶孤對電子的基團配位, 此外, 蛋白質肽鏈中的肽單位O=C─N鏈段,在它們三個原子形成的平面上羥基的π電子有些離域的作用, 即易于與Se(0)的4d軌道通過共用π電子而連接起來。在本實驗條件下, 蛋白分子帶負電荷,因此, 硒納米粒子容易吸附在蛋白質的酰胺平面上,結合成以蛋白分子為核, 小納米粒子為殼的籠狀粒子(圖3-c, d), 其詳細的作用機制尚有待進一步驗證。紅色納米硒本身具有一定的生物活性[16,17], 與具有生物活性的 PC分子結合而成的這種特殊結構的籠狀粒子預期有著不同尋常的功能。
另外, 在富硒螺旋藻的培養(yǎng)中, 也觀察到培養(yǎng)液中有Se(0)的形成。初步研究結果表明藻體對Se(IV)轉化生成的 Se(0)為納米簇狀聚集態(tài), 呈紅色, 但尚未證明是在螺旋藻胞內還是胞外產生, 還是兩者兼之, 離體藻藍蛋白與 Se(IV)作用產生 Se(0)的實驗事實提示了在螺旋藻胞內首先產生Se(0)的可能的分子機制, 即PC是SeO32?的靶分子。因此, 證實SeO32?的氧化作用是導致PC分子損傷的主要原因之一。而在本文觀察中, SeO32?對PC的氧化作用是使PC變性從而引起一系列光譜變化的主要原因。
通過上述觀察可以得出以下結論: 藻藍蛋白分子是Se(IV)的主要靶分子之一, Se(IV)對藻藍蛋白分子可能具有多重作用, 但氧化損傷是主要的; 藻藍蛋白分子對 Se(IV)的還原產物是藻藍蛋白分散的紅色納米 Se(0), 其還原作用提示螺旋藻在 Se(IV)脅迫環(huán)境下細胞內產生紅色納米 Se(0)的分子機制; PC對 Se(IV)的還原及紅色納米硒的生成提供了一種制備納米硒的簡便易行的新方法, 可能具有潛在的應用前景。
[1] Glazer A N. Light guides: Directional energy transfer in a photosynthetic antenna[J]. J Biol Chem, 1989, 1: 1-4.
[2] Singh S P, Singh R P. Bisulphite-induced pigment damage in the blue-green algaNostoc calcicola[J]. New Phytologist, 1984, 2: 277-283.
[3] Sah J F, Krishna K B, Srivastava M,et al. Effects of ultraviolet-B radiation on phycobilisomes ofSynechococcusPCC 7942: alterations in conformation and energy transfer characteristics[J]. Biochem Mol Biol Int,1998, 2: 245-257.
[4] Verma K, Mohanty P. Changes of the photosynthetic apparatus inSpirulina cyanobacteriumby sodium stress[J]. Z Naturforsch (C), 2000, 1-2: 16-22.
[5] Gelagutashvili E S, Belokobyl'ski? A I, Rcheulishvili A N,et al. Interaction of Pb(II) ions with C-phycocyanin fromSpirulina platensis: effect of ionic strength[J].Biofizika, 2003, 4: 589-594.
[6] 陳思嘉, 楊芳, 鄭文杰.硒劑量對鈍頂螺旋藻的生理生化影響[J] .海洋學報, 2007, 29(6): 87-92.
[7] 黃峙, 鄭文杰, 楊芳, 等. 含硒藻藍蛋白抗小鼠實驗性肝損傷的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2002, 7:819-822.
[8] Cases J, Wysocka I A, Caporiccio B,et al. Assessment of selenium bioavailability from high-seleniumSpirulina Subfractionsin selenium-deficient rats[J]. J Agric Food Chem, 2002, 13: 3 867-3 873.
[9] Kessi J, Ramuz M, Wehrli E,et al. Reduction of selenite and detoxification of elemental selenium by the phototrophic bacteriumRhodospirillum rubrum[J].Appl Environ Microbiol, 1999, 11: 4 734 – 4 740.
[10] 李樂農, 張季平, 郭寶江, 等. 富硒螺旋藻中含硒藻藍蛋白的純化、結晶及初步晶體學研究[J]. 中國科學(C輯), 2000, 5: 449-455.
[11] Hilditch C M, Smith A J. Phycocyanin from the cyanobaclerium aphanothece halophytic[J]. Phytochemistry,1991, 11: 3 515-3 517.
[12] Sode K, Horikoshi K, Takeyama H,et al. On-line monitoring of marine cyanobacterial Cultivation based on phycocyanin fluorescene[J]. Journal of Biotechnology, 1991, 21: 209-218.
[13] Schirmer T, Bede W, Huber R,et al. X-ray crystallography structure of light harvesting biliprotein C-phycocyanin from the thermocphilic cyanobacterium,Mastigocladus laminosusand its resembalance to globin structures[J]. J Mol Biol, 1985, 184: 257-277.
[14] 杜林方, 付華龍, 鄒曉東. 銅離子對鈍頂螺旋藻完整細胞中光系統(tǒng)Ⅱ活性和藻膽體能量傳遞的影響[J].植物學報, 1996, 2: 109-113.
[15] Toole C M, Plank T L, Grossman A R,et al. Biolin deletions and subunit stability in cyanobacterial light-harvesting proteins[J]. Molecular Microbiology,1998, 3: 475-486.
[16] Zhang J S, Wang X F, Xu T W. Elemental selenium at nano size (Nano-Se) as a potential chemopreventive agent with reduced risk of selenium toxicity: comparison with Se-methylselenocysteine in mice[J]. Toxicol,Sci, 2007, 101: 22-31.
[17] Chen T F, Wong Y S, Zheng W J,et al. Selenium nanoparticles fabricated inUndaria pinnatifidapolysaccharide solutions induce mitochondria-mediated apoptosis in A375 human melanoma cells[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2008, 67: 26-31.
Received: Oct., 12, 2008
Key words:selenium;Spirulina platensis; phycocyanin; spectra; nano
Abstract:Spectra of interaction between Se(Ⅳ) and phycocyanin (PC), and red Selenium were explored in this paper. PC with an absorbance ratio of 3.1 (A620/A280) was purified fromSpirulina platensis. The characteristic absorbance intensity of PC at 620 nm was decreased gradually after SeO32?was added, and the intensity decreased with the increases of the concentration and incubation time of Se (Ⅳ). But absorbance at 278 nm and 347 nm was gradually increased. As to fluorescence spectra of PC, both emission peak and excitation peak were decreased.Furthermore, the phenomenon of red selenium transformation was observed, and the dominant form of Se (0) was nano selenium as determined by TEM. These results suggested that PC might be a target of SeO32-. Se (Ⅳ) had oxidative stress to PC and Se (Ⅳ) was reduced to red nano selenium.
(本文編輯: 張培新)
Oxidation of phycocyanin by Se(Ⅳ) and formation of nano-Se(0)
YANG Fang1, HUANG Zhi2, GUO Zhen-jiang1, ZHENG Wen-jie1
(1. Dept. of Chemistry & 2. Dept. of Biotechnology, College of Life Science and Technology, Jinan University,Guangzhou 510632, China)
Q51
A
1000-3096(2010)06-0055-04
2008-10-12;
2009-01-05
國家自然科學基金(20771044); 廣東省科技計劃項目(2007B030703007及2008A030201020); 中國博士后基金(20090460787);中央高?;究蒲袠I(yè)務費專項資金(21610303)
楊芳(1976-), 女, 博士, 研究方向: 生物無機化學, E-mail:tyoung@jnu.edu.cn, 電話: 020-85220223; 鄭文杰, 通信作者, E-mail:tzhwj@jnu.edu.cn