袁萬哲，陳立功，朱玉濤，張競乾，景 翠，岳春陽，魏苗苗，黃海瓊，呂 爽，孫繼國

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定071001)

豬鏈球菌病是由C、D、F群及L群等鏈球菌引起的豬的多種疾病的總稱。在臨床上可呈現(xiàn)不同的癥狀，如敗血癥、腦膜腦炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、化膿性淋巴結(jié)炎、關(guān)節(jié)炎等，還常常與其他疾病合并感染，發(fā)病率和死亡率較高。該病分布范圍極廣，世界各地均有發(fā)生。隨著規(guī)模化集約化程度的提高，豬鏈球菌病也屢有發(fā)生，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了一定損失。本工作在流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，對豬鏈球菌河北分離株的形態(tài)、生化特性、溶血特性、藥物敏感及其致病性等生物學(xué)特性進行試驗，報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料 對河北省保定和承德等地區(qū)豬場疑似鏈球菌病的病死豬及時剖檢，無菌采取豬的肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、腦組織和關(guān)節(jié)腔液。

1.2 試劑 微量生化發(fā)酵管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；氟苯尼考等藥物原料由保定市冀農(nóng)動物藥業(yè)公司提供；注射用硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素注射液為華北制藥股份有限公司生產(chǎn)；藥敏紙片參考文獻[3]自制。

1.3 實驗動物 體重20～25 g健康昆明系小鼠購自河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心。

1.4 直接涂片鏡檢 無菌采取病豬的肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結(jié)、腦組織和關(guān)節(jié)腔液涂片，經(jīng)革蘭染色后直接鏡檢。

1.5 培養(yǎng)特性及形態(tài)觀察 將涂片鏡檢中發(fā)現(xiàn)有革蘭陽性成雙或短鏈狀球菌的病料劃線接種鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h，挑取平板上單個可疑菌落涂片染色鏡檢，確定為鏈狀球菌后，置 4℃冰箱備用。

1.6 溶血試驗 以平板法測定6株鏈球菌的溶血特性。將鏈球菌接種于鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h后觀察，根據(jù)菌落周圍出現(xiàn)溶血圈的情況進行判斷。

1.7 生化特性鑒定 上述純化的6株分離菌分別用疊氮鈉血平板，純培養(yǎng)24 h后，選用微量生化發(fā)酵管進行糖發(fā)酵及其他生化試驗。

1.8 動物致病性試驗 取6株豬鏈球菌純培養(yǎng)物，經(jīng)平板計數(shù)后濃度調(diào)至 1×109CFU/mL，按0.2 mL、0.5 mL腹腔各接種3只小鼠，另設(shè)3只作空白對照。隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及死亡情況。對死亡的小鼠剖檢，觀察病理變化，采集臟器染色鏡檢，并于鮮血瓊脂平板上劃線分離培養(yǎng)。

1.9 藥物敏感性測定 按常規(guī)紙片法進行6株分離菌的藥物敏感性試驗。根據(jù)抑菌圈直徑大小判定分離株對藥物的敏感性。20 mm以上為極敏；15～20 mm為高敏；10～14 mm 為低敏；10 mm以下為耐藥。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性及形態(tài)觀察 病料直接涂片鏡檢觀察到的細(xì)菌以短鏈狀革蘭染色陽性球菌為主。經(jīng)鮮血瓊脂平板培養(yǎng)，分離到6株革蘭染色陽性球菌。分離菌在高鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h不見生長，在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上多數(shù)形成淡灰白色、半透明、圓形、濕潤、表面光滑、邊緣整齊的小菌落，菌落直徑約1～2 mm，且大多為α溶血或β溶血，其中CD1株呈β型溶血。鮮血瓊脂平板中以5～8個菌形成的鏈為主。

2.2 生化特性 6株菌均可發(fā)酵葡萄糖、菊糖、蕈糖、馬尿酸鈉，均不發(fā)酵山梨醇、棉籽糖、衛(wèi)矛醇、淀粉、吲哚、枸櫞酸鈉。M.R.、V-P試驗均為陰性。大部分菌株發(fā)酵乳糖、麥芽糖、果糖，不發(fā)酵阿拉伯糖、甘露醇、水楊苷，不液化明膠。

2.3 動物致病性 攻毒組小鼠均100%發(fā)病，并于40 h內(nèi)全部死亡，而對照鼠未見發(fā)病、死亡。死亡小鼠主要表現(xiàn)為血凝不良，腦膜充血，肺臟淤血、水腫，脾臟腫大。從死亡小鼠脾臟均可分離到與注射菌一致的鏈球菌。結(jié)果表明，6株細(xì)菌對小鼠均有一定的致病性。

2.4 藥物敏感性 6株鏈球菌分離物對25種抗菌藥物的敏感性不同，所用藥物的抑菌圈直徑在0～36 mm之間。其中以頭孢哌酮鈉(先鋒必)、先鋒霉素Ⅴ、阿莫西林、氨芐青霉素、氟嗪酸的抑菌效果較好，6株菌對這4種抗生素的高敏率分別是100%、100%、100%、83.3%、83.3%，而分離菌對其他抗生素則有不同程度的耐藥性，尤其是對四環(huán)素和桿菌肽的耐藥率為100%。所有菌株都耐10種以上藥物，表現(xiàn)出多重耐藥性(表1)。

表1 鏈球菌分離株的多重耐藥

3 結(jié)語

3.1 從河北保定、承德地區(qū)部分發(fā)病豬場病死豬體內(nèi)分離到6株細(xì)菌，通過染色、生化試驗、致病性試驗等結(jié)果，鑒定其為豬鏈球菌。

3.2 6株豬鏈球菌分離物均對3種抗菌藥物(先鋒必、先鋒Ⅴ、阿莫西林)極其敏感。所有菌株都對10種以上藥物產(chǎn)生耐藥性，表現(xiàn)出多重耐藥性。

略)