趙家才,毛翔光,馬燕茹,張海瀟,何永富,楊國(guó)榮,黃必志＊

(1.云南省家畜冷凍精液站,云南 昆明 小哨 650212;2.云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院,云南 昆明 小哨 650212)

我們從2002年至今,開(kāi)展了BMY牛細(xì)管冷凍精液及其生產(chǎn)工藝的試驗(yàn)研究,并獲得了較理想的效果。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)BMY牛精液的來(lái)源和采精方法

供試的BMY牛精液為云南草地動(dòng)物科學(xué)研究院通過(guò)云南黃牛為母本,用墨累灰牛為第一父本進(jìn)行雜交,再用婆羅門(mén)牛為第二父本與二元雜交母牛雜交,然后利用三元雜交群體橫交培育的 BMY牛[1],在全放牧條件下用電刺激法采集的新鮮精液。

Research progress of biomass phenolic-based surfactants 11 34

1.2 牛精液冷凍稀釋液的種類(lèi)、必備的條件和稀釋的目的

牛精液冷凍稀釋液主要有檸檬酸鹽——糖類(lèi)稀釋液,奶類(lèi)稀釋液,乳糖類(lèi)稀釋液,三基類(lèi)稀釋液和TES類(lèi)稀釋液等。排出體外的精子,在外界變化的環(huán)境中(如溫度等)精清對(duì)其保護(hù)性是有限的,特別是冷凍解凍的急劇變化。為此進(jìn)行牛精液冷凍保存就要配合使用專(zhuān)門(mén)的溶液先把精液進(jìn)行稀釋等技術(shù)處理。牛精液冷凍稀釋液要適于精子生存,能保護(hù)精子膜的完整性,能抑制對(duì)精子有害的物質(zhì)。牛精液的稀釋是在精液中加入適于精子生存并保持正常授精能力的稀釋液。稀釋的目的主要是增加精液數(shù)量,提高種公牛的利用率,降低精液能量消耗,補(bǔ)充適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)物質(zhì)的活動(dòng)延長(zhǎng)精子的壽命,有利于精子的冷凍和保存[2]。

1.3 牛精液冷凍稀釋液配制、篩選和稀釋方法

1.3.1 牛冷凍稀釋液的配制 以濃度為0.2 mol/L,pH為6.5,含1%果糖的三羥甲基氨基甲烷(T ris)緩沖液,其中抗菌物質(zhì)的添加采用美國(guó)國(guó)家動(dòng)物育種協(xié)會(huì)和商業(yè)化的精液處理者所采用的微生物控制方案:每毫升原精液(未稀釋的)和每毫升稀釋液中分別加入500～1 000 μ g鏈霉素、500～1 000 IU青霉素。按正交設(shè)計(jì)法[3]分別添加不同種類(lèi)的糖和氨基酸[4],配制不同的稀釋液用于試驗(yàn),配制稀釋液時(shí),必須準(zhǔn)確稱(chēng)量所需的各種試劑,所用試劑為生化試劑,純度為分析純。

本試驗(yàn)材料選取兩種不同類(lèi)型的茼蒿為：“小葉茼蒿”和“大葉茼蒿”，于2016年9月定植于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜基地。

1.3.3 精液的稀釋方法 冷凍精液的稀釋方法采用一步稀釋法。一步稀釋法是根據(jù)牛精液的采精量,精子密度和按每支細(xì)管精液最終含2 000～2 500萬(wàn)個(gè)精子,有效精子數(shù)800萬(wàn)以上,確定添加稀釋液的數(shù)量,一次加足所需稀釋液的數(shù)量。一步法稀釋在加入稀釋液時(shí),稀釋液的溫度和精液溫度相差不能超過(guò)5℃。

不同種類(lèi)稀釋液的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

我左沖右突，從密密的樹(shù)叢中擠過(guò)去摘了兩丫桃花，臉上居然劃了一道血口子，不留神讓一株狗兒刺拉了一下。學(xué)著紳士的模樣，我畢恭畢敬地獻(xiàn)給女友，一臉虔誠(chéng)，“嫁給我吧，親愛(ài)的。”

1.4 BMY牛精液品質(zhì)的檢查

1.5 精液的分裝

稀釋后的精液在室溫下用MRS—3分裝印字一體機(jī)把精液分裝于塑料細(xì)管后封口印字標(biāo)記。

1.6 平衡

1.7 精液的冷凍、解凍、包裝和儲(chǔ)存

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類(lèi)稀釋液的效果

田銘拒接范青青的電話(huà)，但范青青直接找上門(mén)，堵住他：“我今晚約你看星星?！狈肚嗲嗥^對(duì)著他笑，笑得胸有成竹。田銘不語(yǔ)。

表2 添加不同種氨基酸和水平的稀釋液BMY牛精液凍精解凍效果比較表

分裝標(biāo)記清楚的精液放入+4℃的冰箱中平衡2～4 h。

從表1和表2看出,對(duì)需試驗(yàn)的不同組合而成的稀釋液,試驗(yàn)時(shí)先將牛精液分成九等分,然后在精液中分別加入等量的不同種類(lèi)的冷凍稀釋液,進(jìn)行不同組合稀釋液冷凍效果的比較。從表1的結(jié)果經(jīng)顯著性檢驗(yàn)和多重比較得出,A糖不同水平之間差異不明顯(P>0.05),B糖不同水平之間的差異極顯著(P<0.01),B1與B2、B3的差異均極顯著,B2與B3的差異也極顯著;C1與C2、C3的差異均極顯著,C2與C3的差異不顯著;不同種糖之間亦無(wú)交互作用。添加不同種糖類(lèi)和水平的稀釋液稀釋BMY牛原精效果,A糖和C糖不同水平之間差異不明顯(P>0.05);B糖不同水平之間的差異極顯著(P<0.01),B1與B3的差異極顯著,與B2的差異不顯著,B2與 B3的差異不明顯;最佳的組合是A2B1C1。

2.2 BMY牛電刺激法的采精結(jié)果

BMY牛用電刺激法采精,收集和測(cè)定公BMY牛的射精量、精子密度,測(cè)定得出公BMY牛的精液量為 9.21±3.66 mL,精子密度為6.99±5.05億/mL,原精活力為0.54±.014,解凍活力0.357±0.029,BMY牛采精成功率為75.3%。凍精產(chǎn)量283±196劑。

3 討論

3.1 優(yōu)選出冷凍保存效果較好的冷凍稀釋液

T RIS—果糖為基礎(chǔ)液添加不同的糖類(lèi)和氨基酸所得的新稀釋液獲得了較好的效果,以添加蔗糖和乳糖的效果明顯,添加氨基酸的效果未能獲得明顯的效果,有待進(jìn)一步完善試驗(yàn)研究方案,提高試驗(yàn)的精確度,冷凍稀釋液是影響B(tài)MY精液冷凍效果的主要因素,還應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)地篩選,今后仍需做深入的試驗(yàn)。不同季節(jié)的差異不明顯,不同年度間存在顯著的差異,不同冷凍方法的冷凍解凍效果存在極顯著的差異,應(yīng)深入進(jìn)行不同冷凍曲線(xiàn)冷凍解凍效果的研究,不同解凍溫度,凍精的解凍活力差異極顯著,操作人員間不同熟練程度明顯存在差異。這與有關(guān)報(bào)道相一致。

3.2 稀釋液種類(lèi)和成分是影響牛精液效果的重要因素

雖然對(duì)原精的保存結(jié)果無(wú)明顯差異,對(duì)精液的冷凍保存效果差異卻較大,稀釋液中糖類(lèi)除了提供能量外,還具有一定的防凍保護(hù)作用,卵黃對(duì)精子抗凍防凍具有重要的作用,TRIS能維持精子細(xì)胞內(nèi)外PH值的平衡和較好的防凍保護(hù)作用[6]。

[1] 吳麗麗,楊國(guó)榮,劉學(xué)洪,等.BM Y和婆羅門(mén)牛早期生長(zhǎng)性狀遺傳力研究[J].黃牛雜志,2005,31(3):12-14.

[2] 李曉強(qiáng),陳興平,賈永紅,等.牛冷凍精液技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)牛業(yè)科學(xué),2006,32(5):59-62+66.

[3] 明道緒.生物統(tǒng)計(jì)附試驗(yàn)設(shè)計(jì)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2004.

[4] 全國(guó)畜牧總站等.牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)與管理[C].115.

[5] 武英.豬精液冷凍技術(shù)研究[J].中國(guó)畜牧雜志,1993,(3):6-8.

[6] 郭年潘(摘譯).綿羊精液冷凍保存技術(shù)研究綜述[J].國(guó)外畜牧科技,1995,22(3)(上)30-34,(下)22-27.