朱昌玲，史勁松，孫達峰，張 和，戚善龍

(1.南京野生植物研究院，江蘇南京210042;2.揚州日興生物科技股份有限公司，江蘇揚州225001)

羧甲基殼聚糖的制備及其在保鮮中的應用

朱昌玲1，史勁松1，孫達峰1，張 和2，戚善龍2

(1.南京野生植物研究院，江蘇南京210042;2.揚州日興生物科技股份有限公司，江蘇揚州225001)

研究了在堿性條件，無溶劑體系下殼聚糖羧甲基化制備工藝，通過IR對反應前后殼聚糖結構進行了表征。最佳反應條件：2 g殼聚糖，在NaOH加入量為5 g、堿化時間為6h、氯乙酸用量為6g、3%KI、反應時間為8 h、反應溫度60℃，產(chǎn)品取代度為1.27。同時研究了羧甲基殼聚糖對辣椒、豬肉涂膜保鮮實驗，結果顯示對辣椒、豬肉具有較好的涂膜保鮮作用。

殼聚糖;羧甲基化反應;保鮮

殼聚糖(Chitosan，Cts)是甲殼素脫乙酰后的產(chǎn)物，是一種天然堿性多糖，由于只能溶解于酸及酸性水溶液中，限制了它的理論研究及生產(chǎn)應用。但殼聚糖具有優(yōu)良的生物親和性和生物可降解性，容易制成各種衍生物［1］。在眾多衍生物中羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl－chitosan，CMC)研究最早，也最引人注目。羧甲基殼聚糖是將羧甲基引入殼聚糖而得到的一類殼聚糖衍生物，通過羧甲基改性，可以破壞殼聚糖分子間的氫鍵，增加其水溶性。使其既能溶于酸中，又能溶于堿中，成為聚兩性電解質(zhì)，從而大大擴大了殼聚糖的應用范圍［2］。由于CMC的水溶性比甲殼素和殼聚糖好，從而得到更好的發(fā)揮功效，可用作化妝品的保濕劑、果蔬保鮮劑、植物生長促進劑、水處理絮凝劑及多種藥物輔劑等［3］。

根據(jù)文獻［4－10］報道，在制備羧甲基殼聚糖時，均需加入異丙醇、1，4－二氧六環(huán)、二甲亞砜(DMSO)等其中一種有機溶劑進行膨化，生產(chǎn)時也不利于乙醇的回收利用。本文對其制備工藝及條件加以改進，在不加膨化劑的基礎上對制備條件進行了研究，優(yōu)化出了最佳制備條件。

由于殼聚糖只能溶解于酸和酸性水溶液中，酸性水溶液損傷了果蔬表層，在很大程度上限制了它在果蔬涂膜保鮮上的應用。羧甲基殼聚糖溶于水，在水溶液中容易形成牢固的膜，此膜對氣體有選擇滲透性，特別適于果蔬保鮮［11］，現(xiàn)將制備的產(chǎn)品對辣椒進行保鮮實驗。另外根據(jù)其抑菌作用，也進行了豬肉保鮮探索，以期能為羧甲基殼聚糖應用于果蔬、肉食保鮮提供一定的基礎資料依據(jù)。

1 材料與方法

1.2 儀器與試劑

儀器：離心機、磁力攪拌器、真空干燥箱、烘箱、PB－10型酸度計、NDJ－1旋轉(zhuǎn)式粘度計、水浴加熱器等;Nicolet670傅立葉變換紅外光譜儀，KBr壓片，掃描范圍為4 000～400 cm－1，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4 cm－1。

殼聚糖：由揚州日興生物科技股份有限公司提供，食品級、脫乙酰度≥90%;

辣椒：市場購買，沒有機械損傷、沒有病蟲害、個頭較大、均勻厚實硬朗的新鮮辣椒;

豬肉：市場購買新鮮豬肉;

實驗所用試劑均為分析純;乙醇為95%、食品級。

1.3 方法

1.3.1 測定方法

1.3.1.1 羧甲基殼聚糖取代度的測定［4］

精確稱取0.5 g干燥至恒重的羧甲基殼聚糖于250 mL容量瓶中，精確移取50 mL 0.1 mol/L鹽酸標準溶液于其中，振搖，使完全溶解，用0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定，同時用pH計測pH值。

取代度的計算公式如下：

式中：A—每克樣品中羧甲基的物質(zhì)的量，mmol;

V1—pH值為2.1時滴定所消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積，mL;

V2—pH值為4.3時滴定所消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積，mL;

W—樣品凈重，g;

M—氫氧化鈉標準溶液濃度，mol/L。

1.3.1.2 辣椒失重率的測定

每次任意取出每組中的一只，稱取辣椒的重量。

式中：m0—第1天辣椒的質(zhì)量;

mn—第N天辣椒的質(zhì)量。

1.3.1.3 辣椒硬度的觀察

物理觀察法，用肉眼觀察辣椒的變化后進行描述記錄。

1.3.1.4 豬肉感官指標

無異味，無酸敗味。

1.3.2 實驗方法

1.3.2.1 羧甲基殼聚糖的制備

稱取2 g殼聚糖于三角瓶中，緩慢加入一定體積的40%NaOH溶液，攪勻，在常溫下進行堿化。加入催化劑。稱取一定量的氯乙酸，分3次投入已堿化的溶液中，每次間隔10 min，然后加熱進行反應。反應結束后加入一定量的蒸餾水，冷卻至室溫，用冰乙酸調(diào)節(jié)溶液pH值至7。將溶液在4000 r/min下，離心15 min，取其上清液。在攪拌狀態(tài)下，將上清液緩慢加入到150 mL 95%乙醇中，靜置2 h，抽濾除去溶劑，用70%左右的乙醇洗滌3次，在60℃下真空烘干，粉碎即得灰白色粉狀羧甲基殼聚糖成品。

1.3.2.2 羧甲基殼聚糖的涂膜保鮮實驗

(1)辣椒保鮮

將辣椒用清水清洗，自然涼干。隨機分成2組，每組6只。第一組：水洗處理，作為對照;另一組：用加一定量的甘油等，配制成的2%羧甲基殼聚糖溶液進行涂膜處理。

分別放入溶液中浸泡1 min，取出晾干，置于室溫下(實驗在夏季，室溫25～30℃)并在塑料薄膜中貯藏。每隔兩天進行測一次理化指標。

(2)豬肉保鮮

將豬肉在自來水下反復沖洗干凈后，用75%酒精擦拭刀具和案板，切成約50 g/塊，分別在下列幾組實驗液中浸泡2 min，取出瀝干后裝在聚苯乙烯泡沫托盤中，用低密度聚乙烯保鮮薄膜加以覆蓋，貯存在(3±1)℃冰箱中，每隔2 d測定其指標。

實驗分組為：Ⅰ、對照組，用無菌蒸餾水;Ⅱ、pH為4.5醋酸緩沖液溶液;Ⅲ、1.0%羧甲基殼聚糖;Ⅳ、用pH為4.5醋酸緩沖液溶液，配制的1.0%羧甲基殼聚糖。

2 結果與討論

2.1 羧甲基殼聚糖的制備條件的優(yōu)化

2.1.1 催化劑對羧甲基化反應的影響

固定其它反應條件，根據(jù)文獻報道，選擇了3種催化劑，對其催化作用進行比較。結果如表1：

表1 催化劑對羧甲基化反應的影響

從表1中看出，KI的催化作用相當明顯。因為KI與C1CH2COONa反應生成ICH2COONa，由于I－的離去能力大于Cl－，因此ICH2COONa更容易與殼聚糖反應，生成羧甲基殼聚糖，但催化劑量繼續(xù)增加，ICH2COONa水解副反應也會增強。

2.1.2 堿化時間對產(chǎn)品的影響

在氯乙酸用量為4 g，反應時間為5 h，反應溫度60℃時，改變殼聚糖的堿化時間，對所得產(chǎn)品的取代度影響進行研究，結果如圖1所示：

圖1 堿化時間對產(chǎn)品取代度的影響

從圖1得知，隨著殼聚糖堿化時間的延長，產(chǎn)品取代度增大，水溶性逐漸變好，但4 h后增加不明顯，所以取6h為最佳堿化時間。

另外，通過實驗得知，羧甲基殼聚糖取代度在0.5以上時，即可全部水溶。

2.1.3 氯乙酸用量比對產(chǎn)品的影響

在堿化時間為6h，反應溫度60℃，反應時間為5 h時，改變氯乙酸用量，對產(chǎn)品的取代度影響見圖2所示：

圖2 氯乙酸用量對產(chǎn)品取代度的影響

取代度隨氯乙酸用量的增加而增加，水溶性也隨著變好，但當氯乙酸用量增加到一定程度時，取代度增大變緩。因為羧甲基化反應主要包括兩種反應：一是氯乙酸與堿的中和及水解反應(副反應);二是氯乙酸鈉與堿化CTS的反應。氯乙酸用量增加，發(fā)生羧甲基化反應的幾率增加，導致DS上升，但當氯乙酸用量繼續(xù)增加時，過量氯乙酸中和了部分NaOH，不利于羧甲基化反應。由此可見，氯乙酸較適宜的用量為6g。

另外，羧甲基化反應是一個放熱反應，如果操作過程中將氯乙酸一次加入，反應十分激烈，很難控制其反應溫度，而且氯乙酸利用率降低。為此，采用分次加入氯乙酸的方法，可有效的提高反應效率。

2.1.4 堿用量對取代度的影響

在浸泡時間為6h，氯乙酸用量為6g，反應溫度60℃，反應時間5 h時，改變氫氧化鈉用量，對產(chǎn)物取代度影響結果見圖3：

圖3 氫氧化鈉用量對羧甲基化反應的影響

由圖可見，隨著氫氧化鈉用量的增加，羧甲基殼聚糖的取代度均呈遞增趨勢，但是堿用量過大時，取代度反而下降了。因為羧甲基化反應是在堿性環(huán)境下進行的，反應體系中堿量的增大，有利于殼聚糖結構單元中更多活性中心形成，產(chǎn)物取代度相應提高。同時也會提高副反應的發(fā)生率，降低氯乙酸的利用率。當氫氧化鈉用量為5 g時，取代度達到最大。

另外，實驗中得知堿量的增加對產(chǎn)品的粘度和色澤沒有顯著的影響。

2.1.5 反應時間對羧甲基化反應的影響

在確定氫氧化鈉用量為5 g，加入3%KI，其他反應條件不變的情況下，考察反應時間對反應產(chǎn)物取代度的影響，結果見圖4。

圖4 反應時間對羧甲基化反應的影響

隨反應時間的延長，取代度呈遞增趨勢，當反應8 h后此趨勢變化緩慢，因此取最佳反應時間為8 h。

2.1.6 反應溫度對取代度的影響

在反應時間為8 h，其他反應條件不變，研究反應溫度的變化對產(chǎn)物取代度的影響，結果見圖5。

圖5 反應溫度對羧甲基化反應的影響

由圖5可知，升高反應溫度有利于殼聚糖的羧甲基化，當溫度升高至60℃時，所得產(chǎn)品的取代度達到最高，超過此溫度產(chǎn)品的取代度反而下降。因為反應溫度的升高使活性中心發(fā)生羧甲基反應的幾率提高，進而取代度有所提高，但溫度高于60℃時，氯乙酸的水解加快，使氯乙酸利用率低不利于取代反應的進行。

2.2 IR分析

圖6 殼聚糖的紅外譜圖

圖7 羧甲基殼聚糖的紅外譜圖

從圖中可以看出，在羧甲基殼聚糖中1 602.7 cm－1、1 424.51 cm－1處出現(xiàn)了羧基鈉鹽的特征峰，分別為—COONa不對稱和對稱伸縮振動吸收峰。在殼聚糖中 1 597.7 cm－1、1 654.62 cm－1為—NH2的變形振動雙峰，在羧甲基殼聚糖中變成單峰，是氨基發(fā)生羧甲基化的標志。再則，在殼聚糖中的3 449.48 cm－1處的寬峰是—OH、—NH2的伸縮振動峰，取代后峰變?nèi)?，說明—OH、—NH2被取代。另外圖7中還存在1 054.29 cm－1處的C—O—C基團的吸收峰，這是羧甲基殼聚糖的特征峰，進一步說明殼聚糖發(fā)生了羧甲基化反應。

2.3 羧甲基殼聚糖的涂膜保鮮實驗結果

2.3.1 辣椒保鮮

2.3.1.1 辣椒涂膜處理后對外觀的影響

表2 涂膜處理對辣椒外觀的影響

從表2可以看出，辣椒進行羧甲基殼聚糖涂膜處理后，外觀情況明顯改觀。因為經(jīng)羧甲基殼聚糖溶液涂膜后，能在其表面現(xiàn)成一層均勻的半透明薄膜，從而使果實在特定的“小氣候”環(huán)境下保存。另外其溶液有一定的抑菌作用。

2.3.1.2 涂膜處理后對辣椒失重率的影響

表3 涂膜處理對辣椒失重率的影響

表3說明，辣椒進行羧甲基殼聚糖溶液涂膜處理后，失重也明顯改善。水是維持細胞正常機能，保持果蔬新鮮的必要條件，失水是造成果蔬細胞生理功能降低，有害物質(zhì)增多，最終導致結構破壞的主要原因。

2.3.2 豬肉保鮮

表4 豬肉的感官測定

從表4看出，醋酸緩沖液處理對豬肉保鮮有一定作用，但其效果明顯低于羧甲基殼聚糖。與醋酸緩沖液的低pH酸抑制微生物生長的機制不同，羧甲基殼聚糖的保鮮作用在于其成膜性和抑菌特性，達到保鮮目的。醋酸緩沖液、羧甲基殼聚糖進行綜合利用，效果更佳。

用pH為4.5醋酸緩沖液溶液，配制的1.0%羧甲基殼聚糖對新鮮豬肉進行涂膜處理，豬肉在(3±1)℃貯藏條件下，其腐敗時間可以延長12 d。

3 結論

(1)在制備羧甲基殼聚糖時，不加入異丙醇、1，4－二氧六環(huán)、二甲亞砜(DMSO)等其中一種有機溶劑進行膨化，同樣可以得到取代度較高的產(chǎn)品。2 g殼聚糖，在NaOH加入量為5 g、堿化時間為6h、氯乙酸用量為6g、3%KI、反應時間為8 h、反應溫度60℃，所得產(chǎn)品的取代度最高為1.27;

(2)通過IR分析，說明殼聚糖發(fā)生了羧化反應;

(3)用羧甲基殼聚糖分別對辣椒、豬肉進行涂膜保鮮實驗，通過對辣椒外觀、失重率的測試比較，證明其對辣椒有很好的涂膜保鮮作用;通過對豬肉的感官測定比較，證明其對豬肉有很好的涂膜保鮮作用。

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Study on Preparation of Carboxymethyl Chitosan and its Application to the Preservation

Zhu Changling1，Shi Jingsong1，Sun Dafeng1，Zhang He2，Qi Shanlong2
(1.Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plant，Nanjing 210042，China;2.Ltd.Yangzhou Rixing Biotechnology Co.，Yangzhou 225001，China)

Carboxymethyl chitosan was synthesized at basic pH without solvent.The molecular conformation of modified chitosan was characterized by FTIR before and after the reaction.The optimum reaction conditions were as follows： alkalization time 6h;mass ratio of chloroacetic acid to chitosan 3∶1;NaOH 2.5∶1;3%KI，reaction temperature 60℃;reaction time 8 h.Carboxymethyl chitosan was obtented with a degree of substitution over 1.27.Further experiment results proved that carboxymethyl chitosan prepared had a very good preservation on film coating antistaling.

Chitosan;Carboxymethytlation;Preservation

O636.1

A

1006－9690(2010)03－0041－05

10.3969/j.issn.1006－ 9690.2010.03.010

2009－09－15

江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項資金項目(BA2009103)。