曹小紅,朱 慧,王春玲,魯梅芳,曾 斌,王愛(ài)華

天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院天津市食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457

灰樹(shù)花胞外多糖對(duì)四氯化碳致小鼠肝損傷的保護(hù)作用

曹小紅,朱 慧,王春玲,魯梅芳,曾 斌＊,王愛(ài)華

天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院天津市食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457

四氯化碳可導(dǎo)致小鼠急性肝損傷,采用灰樹(shù)花胞外多糖(GFP)防治后,對(duì)其血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT),天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和過(guò)氧化氫酶活力 (CAT)以及肝組織勻漿中的丙二醛 (MDA)和乳酸脫氫酶(LDH)進(jìn)行測(cè)定,與模型組相比較,灰樹(shù)花胞外多糖治療組ALT、AST、MDA、LDH活力明顯降低,而 CAT活力明顯升高。通過(guò)組織切片染色可以直觀的看出灰樹(shù)花胞外多糖能顯著減輕肝組織病理變化程度。結(jié)果顯示GFP對(duì) CCL4致小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用。

灰樹(shù)花;胞外多糖;四氯化碳;急性肝損傷

灰樹(shù)花[1](Grifola frondosa)又名貝葉多孔蘑、舞茸、粟蘑等,是藥食兼用的真菌?；覙?shù)花具抗病毒、降血脂、預(yù)防及治療癌癥、調(diào)節(jié)免疫等作用。但目前有關(guān)灰樹(shù)花及其多糖對(duì)抗肝損傷的實(shí)驗(yàn)報(bào)道很少。肝損傷是多種嚴(yán)重肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及最終走向肝功能衰竭的始動(dòng)環(huán)節(jié)和途徑。CCL4是肝臟毒性學(xué)中研究較多的親肝性毒物[2],與病毒性肝炎的癥狀、與肝功能檢測(cè)指標(biāo),病理生理改變及肝病病理變化具有相似性,可模擬病毒性肝炎,對(duì)肝臟具有較強(qiáng)的損傷作用。本文研究了 GFP對(duì) CCL4急性肝損傷小鼠的影響,為以后進(jìn)一步開(kāi)發(fā)灰樹(shù)花保健品及其藥用價(jià)值提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 樣品制備

灰樹(shù)花菌種經(jīng)搖床培養(yǎng)得發(fā)酵液,之后經(jīng)過(guò)醇沉,脫脂,脫蛋白,脫色,透析,冷凍干燥等一系列的處理得到 GFP。所制得的 GFP是白色粉末,易溶于水,且是含雜質(zhì)較少糖蛋白綴合物。灰樹(shù)花胞外多糖是分子量范圍較大的多糖,分子量范圍大約在幾萬(wàn)到幾十萬(wàn)。根據(jù)苯酚-硫酸法檢測(cè)其中性糖含量為 58.08%±0.37%。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種系實(shí)驗(yàn)小白鼠,由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK-(軍)2007-004。

1.3 主要試劑和儀器

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒 (中生北控生物工程制品有限公司),丙二醛、過(guò)氧化氫酶等測(cè)定試劑盒 (南京建成生物工程制品有限公司)。

Ther mo酶標(biāo)儀;LEI CA RM 2015組織切片機(jī)(浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);KD-H烘片機(jī)(浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);KD-P攤片機(jī)(浙江金華市科迪儀器設(shè)備有限公司);721可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器公司);Kendro冷凍離心機(jī)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 化學(xué)性肝損傷動(dòng)物模型建立

肝損傷劑:用食用色拉油配制濃度為 0.2%的四氯化碳油溶液。

損傷方法:濃度為 0.2%的 CCL4油溶液腹腔注射劑量[3]為 10 mL/kg,即 0.2 mL/20 g,腹腔注射(ip)一次。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

健康昆明小鼠常規(guī)飼養(yǎng),稱重后隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組 (control)、CCL4模型組、GFP高劑量組(300 mg/kg體重)、GFP中劑量組 (200 mg/kg體重)、GFP低劑量組 (100 mg/kg體重)、聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性組 (150 mg/kg體重),每組 8只。對(duì)照組以生理鹽水 0.1 mL/10 g灌胃,連續(xù)灌胃給藥 15 d,末次給藥 2 h后,用 0.2%CCL4色拉油 ip進(jìn)行損傷,禁食24 h,斷頭取血。3500 r/min離心 8 min得血清,測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶,天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化氫酶活力,取肝臟 1500 mg按 1∶9比例加入預(yù)冷生理鹽水在冰浴中勻漿,測(cè)定丙二醛含量和乳酸脫氫酶活力。

2.3 生化指標(biāo)測(cè)定方法

2.3.1 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT):連續(xù)監(jiān)測(cè)法。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶作用于由 L-丙氨酸及α-酮戊二酸組成的底物,生成丙酮酸及 L-谷氨酸,丙酮酸與NADH作用,生成L-乳酸和NAD+,340 nm處比色。

2.3.2 血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST):連續(xù)監(jiān)測(cè)法。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶作用于由 L-天門冬氨酸及α-酮戊二酸組成的底物,生成 L-谷氨酸和草酰乙酸,草酰乙酸與NADH作用生成L-蘋果酸和NAD+,340 nm處比色。

2.3.3 過(guò)氧化氫酶(CAT):過(guò)氧化氫酶(CAT)分解H2O2的反應(yīng)可通過(guò)加入鉬酸銨而迅速中止,剩下的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物,在405 nm處測(cè)定其生成量,可計(jì)算出 CAT的活力。

2.3.4 肝勻漿丙二醛:比色法。過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)與硫代巴比妥酸(T BA)縮合,形成紅色產(chǎn)物,532 nm處比色。(5)乳酸脫氫酶(LDH):乳酸脫氫酶(LDH)能催化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸與 2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙,在堿性溶液中呈棕紅色,通過(guò)比色可求出酶活力。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±sd表示,組間比較用t檢驗(yàn),P＜ 0.05表示差異有顯著性,P＜ 0.01表示差異有極顯著性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 GFP對(duì)小鼠血清ALT和AST的影響

由表 1知,CCL4肝損傷模型組小鼠血清 ALT和AST明顯高于對(duì)照組,肝損傷模型成立。GFP3個(gè)劑量對(duì)因肝損傷引起的ALT,AST升高具有顯著的抑制作用,并且基本呈劑量效應(yīng)。

表 1 GFP對(duì)肝損傷小鼠血清ALT和AST的影響Table 1 Effect of GFP on serum ALT and AST in mice of liver Injury

3.2 GFP對(duì)小鼠血清過(guò)氧化氫酶(CAT)的影響

由表 2知,CCL4肝損傷模型組小鼠血清 CAT明顯低于對(duì)照組,肝損傷模型成立。GFP 3個(gè)劑量對(duì)因肝損傷引起的 CAT降低具有顯著的提高作用,并且基本呈劑量效應(yīng)。

3.3 GFP對(duì)小鼠肝勻漿中丙二醛(MDA)的影響

由表 3知,小鼠肝損傷后,其肝臟中過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量顯著提高,預(yù)先給予GFP,可降低 CCL4肝損傷后引起的脂質(zhì)過(guò)氧化作用,抑制了MDA的升高,并且基本呈劑量效應(yīng)。

表 3 GFP對(duì)肝損傷小鼠肝勻漿中丙二醛(MDA)的影響Table 3 Effect of GFP onMDA of hepatic homogenate in mice of liver injury

3.4 GFP對(duì)小鼠肝勻漿中乳酸脫氫酶(LDH)的影響

由表 4知,小鼠肝損傷后,其肝臟中乳酸脫氫酶活力顯著提高,預(yù)先給予 GFP,可降低 CCL4肝損傷后引起的脂質(zhì)過(guò)氧化作用,抑制了乳酸脫氫酶活力的升高,并且基本呈劑量效應(yīng)。

表 4 GFP對(duì)肝損傷小鼠肝勻漿中乳酸脫氫酶(LDH)的影響Table 4 Effect of GFP on LDH of hepatic homogenate in mice of liver injury

3.5 小鼠肝臟組織的病理變化

正常對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)組織正常,肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈細(xì)胞索排列整齊,細(xì)胞核分布均勻,呈球形;肝損傷模型組小鼠肝組織損傷嚴(yán)重,肝細(xì)胞排列紊亂,中央靜脈區(qū)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,多數(shù)肝細(xì)胞呈細(xì)胞水腫,氣球樣變[4]可見(jiàn)明顯的點(diǎn)狀、灶狀壞死;GFP劑量組細(xì)胞排列較為整齊,中央靜脈區(qū)很少的炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,肝小葉較為清晰,基本呈現(xiàn)細(xì)胞索排列,很少看到壞死病灶,有少許變性。

圖 1 GFP對(duì) CCL4所致小鼠急性肝損傷組織病理學(xué)影響(HE,×40)Fig.1 Effect of GFP on histopathology ofmice with acute hepatic injury induced by CCL4(HE,×40)

4 討論

GFP能降低 CCL4升高的血清 ALT和 AST水平,顯著減輕肝細(xì)胞變性壞死與炎細(xì)胞浸潤(rùn),提示GFP具有抑制炎癥反應(yīng)和肝臟保護(hù)作用。GFP低、中、高劑量組的抗 CCL4肝損傷的作用相比較而言,雖然高劑量組的效果比中劑量組高出的部分不是很明顯,但也可以說(shuō)明本試驗(yàn)基本呈現(xiàn)劑量效應(yīng),如果從用藥量和經(jīng)濟(jì)效益上考慮,中劑量也能發(fā)揮較好的作用。CCL4造成的肝損傷是典型的自由基損傷,可顯著降低CAT酶活性,升高M(jìn)DA、LDH酶活力水平。同時(shí),激活 Kupffer細(xì)胞及中性粒細(xì)胞,影響肝細(xì)胞的DNA合成和分裂,引起急性肝損傷[5]。

GFP能顯著升高 CAT酶活性,降低MDA、LDH酶活力水平,提示 GFP對(duì)肝損傷的保護(hù)作用與其清除自由基、提高抗氧化酶活性有關(guān)。

總之,本研究表明 GFP對(duì) CCL4誘導(dǎo)的化學(xué)性急性肝損傷動(dòng)物模型具有明顯的保護(hù)作用。據(jù)報(bào)告[6]CCL4進(jìn)入人體經(jīng)肝細(xì)胞色素 P-450的代謝激活后。生成三氯甲基(·CCL3)自由基,迅速引起生物膜脂質(zhì)的過(guò)氧化,從而破壞了生物膜結(jié)構(gòu)和正常生理功能,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ALT和 AST外溢,使血清中ALT與AST活性升高[7]乃至肝細(xì)胞壞死,也有人認(rèn)為 CCL4經(jīng)代謝激活后生成的自由基與細(xì)胞膜的大分子物質(zhì)進(jìn)行不可逆結(jié)合,破壞了肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。初步的研究發(fā)現(xiàn),其機(jī)制可能與清除自由基、提高抗氧化酶活性等作用有關(guān),進(jìn)一步深入研究灰樹(shù)花多糖的抗肝損傷作用可望將其開(kāi)發(fā)為新的治療肝病藥物。

致謝:本文在實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、操作及文章的撰寫(xiě)過(guò)程中,得到了天津科技大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與衛(wèi)生研究室曹小紅老師,王春玲老師,魯梅芳老師,曾斌老師和侯麗華老師的大力支持,在此誠(chéng)摯的謝謝他們!

1 Bian DP(卞冬萍),Yang ZQ(楊振泉),Fang WM(方維明).Advance in the study on characteristics of extracellular polysaccharide fromGrifola frondosa.M od Food Sci Tech(現(xiàn)代食品科技),2005,12:247-250.

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4 Xiao G(肖剛),WangQ(王勤).Protect ive effectofmogrosides on exper imental liver injury in mice.2.China Phar m(中國(guó)藥房),2008,3:163-165.

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Protective Effect of Exo-polysaccharides Produced byGrifola frondosaon Carbon Tetrachloride Induced L iver Injury in M ice

CAO Xiao-hong,ZHU Hui,WANG Chun-ling,LU Mei-fang,ZENG bin＊,WANGAi-hua
Tianjin University of Science&Technology,College of Food Engineering and B iotechnology Tianjin key Laboratory of food Nutrition and Safety,Tianjing 300457,China

Acute hepatic injurymodelwas induced by CCl4in mice to study the protective effect of exo-polysaccharides produced by Grifola frondosa(GFP)on experimental liver injury in mice.The activities of alanine aminotransfe(ALT), aspartate aminotransferase(AST),catalase(CAT)in serum,lactate dehydrogenase(LDH),and the content of maleic dialdehyde(MDA)in the liver tissue were investigated,and the histological changes of liver were observed.GFP could decrease the serum activities ofALT,AST,and the activity ofLDH,MDA content in liver tissue,but increase the serum activities of CAT ofmice with acute hepatic injury induced by CCl4,and it could lessen the histological changesof liver. Consequently,we can see clearly that GFP showed protective effect on mice with acute hepatic injury.

Grifola frondosa;exo-polysaccharides;carbon tetrachloride;acute hepatic injury

Q485

A

1001-6880(2010)05-0777-04

2009-06-22 接受日期:2009-11-11

＊通訊作者 Tel:86-22-60601428;E-mail:zengbin@gmail.com