叢艷君，任發(fā)政，云戰(zhàn)友

(1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010080)

β-乳球蛋白IgE抗原決定簇的識(shí)別

叢艷君1，任發(fā)政2,*，云戰(zhàn)友3

(1.北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010080)

以β-乳球蛋白氨基酸序列為模板，錯(cuò)位合成β-乳球蛋白多肽，以收集到的牛乳過敏患者血清為抗體，鑒定β-乳球蛋白IgE抗原決定簇，分析影響致敏性的關(guān)鍵氨基酸，探討牛乳過敏機(jī)理。結(jié)果表明：β-乳球蛋白IgE抗原決定簇有4條，氨基酸序列分別為17～31、72～86、92～106、152～166，并且蘇氨酸(AA20)、蛋氨酸(AA23)、天冬氨酸(AA27)是影響β-乳球蛋白致敏性的關(guān)鍵氨基酸。說明特異性水解抗原決定簇或定點(diǎn)修飾氨基酸可以實(shí)現(xiàn)過敏原脫敏的目的。

牛奶；β-乳球蛋白；IgE；抗原決定簇

Abstract：A series of overlapping decapeptides (offset by five amino acids) were synthesized on the basis of the amino acid sequence of β-lactoglobulin. IgE-binding epitopes were identified using individual sera from cow milk allergic patients. In addition,we also identified critical amino acids (AAs) for IgE binding. The results showed that four IgE-binding epitopes were identified,which located in the sequences of AA 17－31, AA 72－86, AA 92－106 and AA 152－166, respectively. Threonine,methionine and aspartic acid were the critical amino acids for allergenicity of β-lactoglobulin.

Key words：cow milk；β-lactoglobulin；IgE；epitope

β-乳球蛋白占牛乳總蛋白的10%，乳清蛋白的50%。IgE介導(dǎo)的牛乳過敏中60%的病人對(duì)β-乳球蛋白過敏[1]。β-乳球蛋白一般是二聚體，其每個(gè)單位為18kD，含有162個(gè)氨基酸，5個(gè)二硫鍵，其中4個(gè)為鏈內(nèi)，1個(gè)為鏈間。有關(guān)牛乳過敏原表位的研究在2000年左右最為活躍，其內(nèi)容涉及到對(duì)B細(xì)胞表位(包括IgE表位和IgG表位)及T細(xì)胞表位的研究。Sélo等[2]在研究β-乳球蛋白時(shí)，確定了人的主要IgE表位為肽鏈1～8、25～40、41～60、102～124、149～162 位，同時(shí)21～40、42～60、107～117、148～162位也被致敏的大鼠所識(shí)別。而Fritsché等[3]研究表明：β-乳球蛋白氨基酸序列41～60、102～124、149～162位，這3個(gè)表位被90%～100%過敏患者的血清所識(shí)別，是主要過敏表位，肽鏈1～8、25～40、92～100位，被50%～65%過敏患者血清IgE所識(shí)別，為次要過敏表位。目前對(duì)β-乳球蛋白的IgG表位研究則較少，只確定了6個(gè)識(shí)別位點(diǎn)：肽鏈1～16、51～64、67～88、85～96、129～144、139～156位，其中1～16位和58～96位為次要識(shí)別位點(diǎn)，其余為主要識(shí)別位點(diǎn)[4]。關(guān)于β-乳球蛋白抗原決定簇的關(guān)鍵氨基酸的研究報(bào)道很少。

各國牛乳患者過敏血清不同，本研究收集中國牛乳過敏患者血清，鑒定β-乳球蛋白IgE抗原決定簇及影響致敏性的關(guān)鍵氨基酸，以期為牛乳過敏的臨床診治及低過敏牛乳制品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-乳球蛋白、HRP標(biāo)記的鼠抗人IgE(ε鏈特異性)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、三氟乙酸(TFA) 美國Sigma公司；鏈霉親和素(SA) 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板 美國Costar公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Bio-Rad550型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；PSH500A生化培養(yǎng)箱 中國重慶銀河實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；F-32酸度計(jì) 日本崛廠制作公司；Th-80D-2B型凍干機(jī) 北京天地精儀科技有限公司；高效液相Vydac C18柱 美國Vydac公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽的合成

采用Fmoc固相肽合成法[5]，將C-末端氨基酸連接到一種合適的固相載體上，采用常規(guī)Fmoc法進(jìn)行逐步縮合。合成結(jié)束后，用強(qiáng)酸將序列從固相載體上切割下來，經(jīng)HPLC純化，冷凍干燥后備用。

1.3.2 合成多肽的純化和鑒定

采用高效液相色譜(RP-HPLC)和質(zhì)譜進(jìn)行分析。色譜條件：色譜柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%TFA的溶液，B為乙腈，采用按體積分?jǐn)?shù)梯度洗脫程序：0～5min，15% B；5～10min，20% B；10～30min，40% B。流速：1.0mL/min；檢測波長：220nm；柱溫：20℃。質(zhì)譜條件：采用ESI離子源，噴霧壓力：15psi；干燥氣溫度：350℃；流速：5L/min；掃描質(zhì)量范圍：m/z 500～2200u。

1.3.3 牛乳過敏患者血清的收集

按照文獻(xiàn)[2]相關(guān)參數(shù)(典型的食物過敏史、皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)、Immunol CAP實(shí)驗(yàn))篩選牛乳過敏患者血清。6份牛乳過敏患者血清用來識(shí)別β-乳球蛋白IgE抗原決定簇，以A～F表示。另外取5份血清等體積混合分析影響β-乳球蛋白致敏性的關(guān)鍵氨基酸。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)鑒定抗原決定簇及關(guān)鍵氨基酸

合成多肽致敏性的檢測在96孔微板上進(jìn)行，每孔均先用鏈霉親和素包被，分別依次加入待進(jìn)行抗原決定簇鑒定的肽系列，再用抗體檢測，具體操作參考文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-乳球蛋白肽的合成

以β-乳球蛋白氨基酸序列為模板，用Fmoc固相合成法錯(cuò)位合成β-乳球蛋白多肽30條(錯(cuò)位氨基酸為5個(gè))，見表1。

表1 合成多肽氨基酸序列Table 1 Amino acid sequence of synthesized peptides

2.2 合成多肽的純化及鑒定

合成的多肽通過高效液相純化，純度都達(dá)到了80%以上，進(jìn)一步通過質(zhì)譜鑒定多肽的相對(duì)分子質(zhì)量(加上生物素的相對(duì)分子質(zhì)量)，表明多肽相對(duì)分子質(zhì)量誤差均小于5%。本實(shí)驗(yàn)代表性的附上了兩條多肽(偶聯(lián)生物素)的質(zhì)譜圖(圖1、2)。

圖1 Biotin-LIVTQTMKGLDIQKV多肽的MS圖譜Fig.1 MS spectrum of the peptide containing LIVTQTMKGLDIQKV sequence coupled with biotin

圖2 Biotin-TKIPAVFKIDALNEN多肽的MS圖譜Fig.2 MS spectrum of the peptide containing TKIPAVFKIDALNEN sequence coupled with biotin

2.3 β-乳球蛋白IgE抗原決定簇的識(shí)別

由圖3可知，A患者識(shí)別到的抗原決定簇為B01、B04、B07、B12、B16、B20、B25、B26；B 患者識(shí)別到的抗原決定簇為B01、B03、B09、B12、B14、B20、B26、B30；C患者識(shí)別到的抗原決定簇為B01、B02、B05、B10、B14、B16、B19、B25、B28、B29；D患者識(shí)別到的抗原決定簇為B01、B04、B07、B12、B16、B23、B28、B30；E患者識(shí)別到的抗原決定簇為B01、B06、B12、B15、B22、B28；F患者識(shí)別到的抗原決定簇為B01、B02、B04、B07、B12、B16、B20、B26、B28。

表2 IgE抗原決定簇在β-乳球蛋白序列中的定位Table 2 Location of IgE-binding epitopes on β-lactoglobulin

圖3 A～F牛乳過敏患者識(shí)別β-乳球蛋白IgE抗原決定簇Fig.3 Identification of immunodominantβ-lactoglobulin epitopes from cow milk allergic patients numbered A through F

本研究以牛乳過敏患者血清反應(yīng)率為65%以上的多肽為抗原決定簇。由圖3可知，編號(hào)為B01多肽的識(shí)別率為100%(6/6，即與6份血清均發(fā)生免疫反應(yīng))；B12的識(shí)別率為83.3%(5/6)；B16、B28的識(shí)別率為66.7%(4/6)；B04、B07、B20、B26的識(shí)別率為50%(3/6)；個(gè)別個(gè)體血清對(duì)B03、B05、B09、B10、B29、B30發(fā)生免疫反應(yīng)。因此，B01、B12、B16、B28為抗原決定簇，其氨基酸序列分別為LIVTQTMKGLDIQKV、ILLQKWENGECAQKK、TKIPAVFKIDALNEN、FDKALKALPMHIRLS。4條抗原決定簇在β-乳球蛋白氨基酸序列中的定位分別為17～31、72～86、92～106、152～166，結(jié)果見表2粗體部分。多肽17～31識(shí)別率為100%，是顯性抗原決定簇。用非牛乳過敏患者血清識(shí)別抗原決定簇的OD450nm均低于0.1，本實(shí)驗(yàn)未附陰性對(duì)照的具體數(shù)據(jù)。

2.4 β-乳球蛋白IgE顯性抗原決定簇(LIVTQTMK GLDIQKV)關(guān)鍵氨基酸的分析

為了找到影響致敏性的關(guān)鍵氨基酸，本研究選用分子較小的中性丙氨酸作為取代氨基酸。用丙氨酸依次取代LIVTQTMKGLDIQKV抗原決定簇的氨基酸，以未取代的抗原決定簇(AA17～31)作對(duì)照，由圖4可知，第25位的甘氨酸被丙氨酸取代后的多肽致敏性增強(qiáng)，第20位的蘇氨酸被丙氨酸取代合成的多肽、第23位蛋氨酸被丙氨酸取代合成的多肽及第27位的天冬氨酸被丙氨酸取代合成的多肽光密度值為零，多肽致敏性消失，其他氨基酸被丙氨酸取代后的多肽光密度值與對(duì)照相差不大。因此蘇氨酸(AA20)、蛋氨酸(AA23)、天冬氨酸(AA27)是影響β-乳球蛋白致敏性的關(guān)鍵氨基酸。

圖4 影響β-乳球蛋白致敏性的關(guān)鍵氨基酸Fig.4 Critical amino acids for allergenicity of β-lactoglobulin

3 討 論

Ⅰ型速發(fā)型超敏反應(yīng)一般是由IgE介導(dǎo)的，鑒定牛乳過敏原IgE抗原決定簇，對(duì)于指導(dǎo)臨床診治牛乳過敏疾病及降低牛乳過敏原的致敏性均具有重要意義。有研究表明，在臨床診斷牛乳過敏疾病時(shí)，發(fā)現(xiàn)αs1-酪蛋白抗原決定簇的特異性IgE抗體[7]。

人乳中β-乳球蛋白含量幾乎為零，但是β-乳球蛋白與一些人類及動(dòng)物lipocalin蛋白家族具有同源性。據(jù)報(bào)道這一類蛋白具有強(qiáng)致敏性，許多動(dòng)物源性過敏原，如馬的主要過敏原Equ c1、幾種主要的鼠源性尿蛋白等都屬于這類蛋白[8]。

早在乳蛋白的水解物中就發(fā)現(xiàn)了β-乳球蛋白的致敏片斷[9-11]。本研究通過化學(xué)合成多肽的方法分析抗原決定簇，用6位牛乳過敏患者血清識(shí)別到β-乳球蛋白IgE抗原決定簇4條，其氨基酸序列分別為LIVTQTMKGLDIQKV、ILLQKWENGECAQKK、TKIPAVFKIDALNEN、FDKALKALPMHIRLS。其中識(shí)別率最高的LIVTQTMKGLDIQKV位于β-乳球蛋白的第17～31位，主要是由疏水性氨基酸構(gòu)成，可能位于乳球蛋白的內(nèi)部，在外界因素處理?xiàng)l件下才有可能暴露出來，而之前研究發(fā)現(xiàn)的抗原決定簇多位于分子表面的親水性片段(AA124～134)[7,9-10]。氨基酸序列為AA17～31的IgE抗原決定簇位于β-乳球蛋白的N端，是顯著區(qū)別于其他科屬蛋白的保守序列，抗原決定簇AA152～166位于β-乳球蛋白的C端，與其他乳源蛋白序列具有相似性，此結(jié)論很好的解釋了乳蛋白之間存在的免疫交叉反應(yīng)性的原因。Ball等[12]發(fā)現(xiàn)的肽鏈97～108和Heinzmann等[11]識(shí)別的肽鏈95～113與本研究識(shí)別的肽鏈92～106抗原決定簇相一致。另外，本研究還識(shí)別到ILLQKWENGEC AQKK(AA72～86)和FDKALKALPMHIRLS(AA152～166)兩條抗原決定簇，這在其他研究中尚未見報(bào)道。

找到IgE結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，通過基因工程或氨基酸修飾的方法降低過敏原致敏性是當(dāng)前學(xué)者致力研究重點(diǎn)?；ㄉ^敏原Ara h1、Ara h2和Ara h3取代單個(gè)氨基酸可以實(shí)現(xiàn)IgE結(jié)合能力喪失或降低[8-10]，而蝦過敏原Pen a1需要取代兩個(gè)以上氨基酸才能實(shí)現(xiàn)脫敏的目的[12]。本研究表明通過取代單個(gè)氨基酸可以實(shí)現(xiàn)β-乳球蛋白IgE結(jié)合能力的喪失，進(jìn)而可以通過基因工程或氨基酸修飾的方法降低β-乳球蛋白致敏性，為低過敏嬰兒配方粉的開發(fā)提供依據(jù)。

[1] TAYLOR S L. Immunologic and allergic properties of cow' s milk proteins in humans[J]. J Food Protection, 1986, 49(3): 239-250.

[2] SELO I, NEGRONI L, CREMINON C, et al. Allergy to bovine betalactoglobulin: specificity of human IgE using CNBr derived peptides[J].Int Arch Allergy Immunol, 1998, 117(1): 20-28.

[3] FRITSCHE R, ADEL-PATIENT K, BERNARD H, et al. IgE-mediated rat mast cell triggering with tryptic and synthetic peptides of bovine βlactoglobulin[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2005, 138(4): 291-297.

[5] BARNETT D, BALDO B A, HOWDEN M E. Multiplicity of allergens in peanuts[J]. J Allergy Clin Immunol, 1983, 72(1): 61-68.

[6] 哈洛E, 萊恩D. 抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南[M]. 沈關(guān)心, 龔非力, 譯. 北京:科學(xué)出版社, 2002: 240.

[7] WILLIAMS S C, BADLEY R A, DAVIS P J, et al. Identification of epitopes within beta-lactoglobulin recognized by polyclonal antibodies using phage display and PEPSCAN[J]. J Immunol Methods, 1998, 213(1): 1-17.

[8] FENNMA O R. 食品化學(xué)[M]. 3 版. 王璋, 譯. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2003: 715.

[9] ADAMS S L, BARNETT D, WALSH B J, et al. Human IgE-binding synthetic peptides of bovine β -lactoglobulin and α -lactalbumin. In vitro cross-reactivity of the allergens[J]. Immunol Cell Biol, 1991, 69(Pt3): 191-197.

[10] TOKITA F. Some readings on antigenic determinants of bovine milk protein[J]. Japan J Dairy Sci, 1985, 34: 229-235.

[11] HEINZMANN A, BLATTMANN S, SPUERGIN P, et al. The recognition pattern of sequential B cell epitopes of beta-lactoglobulin does not vary with the clinical manifestations of cow's milk allergy[J]. Int Arch Allergy Immunol, 1999, 120(4): 280-286.

[12] BALL G, SHELTON M J, WALSH B J, et al. A major continuous allergenic epitope of bovine beta-lactoglobulin recognized by human IgE binding[J]. Clin Exp Allergy, 1994, 24(8): 758-764.

Identification of IgE-binding Epitopes on β-lactoglobulin

CONG Yan-jun1，REN Fa-zheng2,*，YUN Zhan-you3
(1. School of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China；3. Inner Mongolia Yili Industrial Group Co. Ltd., Hohhot 010080, China)

TS252.1

A

1002-6630(2010)15-0190-04

2009-11-18

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD04A06)

叢艷君(1978—)，女，講師，博士，主要從事乳蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究。E-mail：congyj@th.btbu.edu.cn

*通信作者：任發(fā)政(1962—)，男，教授，博士，主要從事功能乳制品研究。E-mail：renfazheng@263.net