殷 捷，盧姍姍，張少輝,2，高艷玲，付麗娜,2,*

(1.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240；2.上海交通大學陸伯勛食品安全中心，上海 200240)

不同瑞士乳桿菌發(fā)酵牛乳產(chǎn)肽的比較研究

殷 捷1，盧姍姍1，張少輝1,2，高艷玲1，付麗娜1,2,*

(1.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240；2.上海交通大學陸伯勛食品安全中心，上海 200240)

為了從3株瑞士乳桿菌(JCM1120、CICC6024和實驗室保存菌株L0906)中篩選出1株產(chǎn)肽豐富的瑞士乳桿菌作為后續(xù)實驗用菌株。采用水解度、pH值、小肽含量3個指標設(shè)計實驗。結(jié)果表明：產(chǎn)酸能力最強的菌株CICC6024在相同發(fā)酵過程中最大水解度明顯高于其他菌株；菌株CICC6024和菌株JCM1120的小肽含量在發(fā)酵時間16h處達到最大，菌株L0906的發(fā)酵活性較為緩慢，在發(fā)酵時間28h尚未達到頂峰；另外小肽的反相液相色譜峰圖顯示，菌株16h時CICC6024菌對應(yīng)的20mAU以上的小肽峰多達19個。通過比較，最后選定CICC6024菌株作為后續(xù)實驗用菌株，發(fā)酵時間為16h。

瑞士乳桿菌；pH值；水解度；小肽含量

Abstract ：Three Lactobacillus helveticus strains (JCM1120, CICC6024 and L0906) were individually used to ferment fat-free milk powder. During 30 hours of fermentation, the changes in degree of hydrolysis (DH), pH and number of small peptides were examined periodically. The results indicated that CICC6024 strain had the strongest acid-producing ability and resulted in the highest maximum DH and the contents of small peptides in milk fermented by Lactobacillus helveticu CICC6024 and JCM1120 both reached their maximum amounts at 16 h; however, the fermentation activity of L0906 strain was relatively lower and still did not reach the peak at 28 h. In addition, 19 peaks with height of more than 20 mAU were observed in the RP-HPLC profile of the 16 h fermentation product of stain CICC6024. These investigations suggest that CICC6024 is an optimal strain for the production of small peptides derived from fermented milk and the optimal fermentation period is 16 h.

Key words：Lactobacillus helveticu；pH；degree of hydrolysis；content of small peptides

乳蛋白肽鏈分子中存在多種生物活性片段(肽類)，這些片段雖在母體蛋白質(zhì)中未顯示出活性，但是經(jīng)特定方式水解游離出來后就可以顯示出不同的生物學活性。迄今，已發(fā)現(xiàn)了多種來源于乳蛋白的生物活性肽，如抗血栓肽、抗高血壓肽、抗氧化肽、免疫調(diào)節(jié)肽等[1]。通常，獲取乳蛋白源活性肽有兩種方式：一是酶解方式，即利用消化道酶以及植物或微生物來源的蛋白酶水解乳蛋白，獲取乳蛋白源活性肽：二是利用微生物(如乳酸菌)的蛋白酶系發(fā)酵乳蛋白來獲取乳蛋白源活性肽。瑞士乳桿菌可以將完整的乳蛋白水解進而釋放許多生物活性肽和氨基酸，然后借助其細胞中特定的運輸系統(tǒng)將氨基酸、二肽、三肽和一些寡肽(不超過18個氨基酸)運送進入胞內(nèi)(這些小肽往往對人體的免疫系統(tǒng)也有促進作用)，以滿足自身生長所需的氮源，而剩余的寡肽則會殘留于乳中[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，不超過20個氨基酸的小肽對人體的免疫系統(tǒng)具有促進作用[3]，換算到小肽的分子質(zhì)量來說也就是最多不能超過3kD，因此本實驗探索發(fā)酵牛乳中分子質(zhì)量小于3kD的小肽含量與牛乳水解度以及pH值之間的關(guān)系，找出發(fā)酵牛乳產(chǎn)肽較多的瑞士乳桿菌并確定其最適的發(fā)酵條件，為后續(xù)實驗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉 新西蘭Fonterra公司。

L-leucine(GS0045)、三硝基苯磺酸(TNBS) 美國Sigma公司；NaDodSO4國藥集團化學試劑公司；Agilent SC-18色譜柱(4.6mm×150mm，3.5μm) 美國Agilent公司；乙腈 美國Fisher公司；超濾膜(分子質(zhì)量3kD和10kD)、超純水 美國Millipore公司；其他試劑均為分析純。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

3株瑞士乳桿菌：CICC6024 廣東菌種保藏中心；JCM1120 中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心；L0906實驗室保存菌株。

MRS液體培養(yǎng)基(每升)：蛋白胨5g、牛肉膏10g、酵母膏5g、磷酸二氫鉀2g、檸檬酸銨2g、乙酸鈉5g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、葡萄糖20g、吐溫-80 1mL，調(diào)節(jié)pH6.2～6.4。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外分光光度計(配有UVProbe數(shù)據(jù)處理軟件) 日本Shimadzu公司；AKTA purify10(配有可變波長紫外檢測器和UNICORN 5.11數(shù)據(jù)處理軟件) 美國GE公司；PHS-3D型pH計 上海智光儀器有限公司；GL-22M高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；Amicon 8400超濾器 美國Millipore公司。

1.4 方法

1.4.1 發(fā)酵牛乳的制備

分別將3株菌在MRS液體培養(yǎng)基中活化3代后按照體積分數(shù)2%的接種量接種到質(zhì)量濃度12g/100mL的脫脂乳中活化兩代直到菌種活力完全恢復[4]。然后按照2%的接種量接種到12g/100mL脫脂乳中搖勻后分裝到15mL滅菌塑料管中，40℃搖床發(fā)酵，根據(jù)之前做過的瑞士乳桿菌生長曲線按0～28h內(nèi)每隔2h為一個時間點，取樣；每個時間點取3個樣品做平行。

1.4.2 pH值測定

采用pH計直接測定不同菌株發(fā)酵脫脂乳不同時間的pH值。

1.4.3 牛乳水解度(DH)測定

參照Adler-Nissen[5]采用的TNBS法測定牛乳的水解度。用質(zhì)量濃度0.1g/100mL的TNBS測定水解液中游離α-NH2的含量來測定牛乳的水解度。游離的α-NH2濃度從L-leu(亮氨酸)標準曲線上讀出。實驗中得出的標準曲線是y＝0.37994x＋0.01228，r＝0.99829。

1.4.4 反相色譜(reverse phase chromatogram，RPC)法測定發(fā)酵上清中的小肽含量

不同發(fā)酵時間的樣品分別用30g/100mL的(NH4)2SO4沉淀后4℃、8000r/min離心10min取上清，然后將上清液依次通過10、3kD的超濾膜[6]。選用Agilent SC-18色譜柱，以乙腈和水的混合液進行梯度洗脫，乙腈的體積分數(shù)以4%/min的速率從2%變化到100%，流速1mL/min，取上述濾液進行反相色譜分離。濾液中的小肽按照親水性大小依次從柱子中洗脫下來，在215nm波長處記錄吸收峰。使用譜線峰的面積積分反映小肽的含量[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 3株瑞士乳桿菌菌株對中乳水解度的影響

圖1 3株菌對牛乳水解度隨發(fā)酵時間的變化Fig.1 Change in DH of at-free milk during fermentation by L0906,CICC6024 or JCM1120

如圖1所示，3株菌對應(yīng)的水解度曲線的線性基本是一致的，菌株CICC6024在相同發(fā)酵過程中對牛乳的最大水解度明顯高于其他兩株菌，最大水解度為3%，而JCM1120和L0906分別為1.4%和2.2%。由此說明CICC6024水解脫脂乳的能力較強。

2.2 牛乳水解度與產(chǎn)酸能力之間的關(guān)系

圖2 3株菌發(fā)酵脫脂乳pH值隨發(fā)酵時間的變化Fig.2 pH change of fat-free milk during fermentation by L0906,CICC6024 or JCM1120

由圖2可知，乳桿菌發(fā)酵牛乳會將乳糖水解成乳酸從而使pH值降低，一開始pH值下降的較為緩慢，到達一定的時間迅速下降，這一點在CICC6024菌上表現(xiàn)的特別明顯。結(jié)合圖1可知，發(fā)酵14h之后CICC6024菌的pH值相對較低，水解度較大。說明產(chǎn)酸能力在一定程度上可以反映其水解能力。但是并不能得出產(chǎn)酸能力強產(chǎn)肽能力就必定強的結(jié)論，王宇等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的產(chǎn)酸能力只是發(fā)酵能力的一個必要非充分條件，就是說發(fā)酵能力強的菌株通常也具有強的產(chǎn)酸能力。

2.3 牛乳水解度與分子質(zhì)量3kD以下小肽含量的關(guān)系

圖3 3種菌發(fā)酵脫脂乳水解度和產(chǎn)肽量隨發(fā)酵時間的變化Fig.3 Change in DH and content of small peptides in fat-free milk during fermentation by L0906, CICC6024 or JCM1120

從圖3可以看出，CICC6024菌和JCM1120菌的小肽峰面積都在16h處達到最大，之后呈下降趨勢，而此刻的水解度并未到達最大，由此推斷活性小肽多在菌株的對數(shù)期和穩(wěn)定期的前期產(chǎn)生，而且這些小肽可能是菌株生長所必需的原料[2]，因此在發(fā)酵的后期這些小肽的峰面積會有所下降。而L0906菌發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)肽速率相對太慢，在前24h小肽的峰面積都保持較低的水平，基于生產(chǎn)工藝以及工業(yè)化生產(chǎn)成本的考慮，拒絕產(chǎn)肽較多但發(fā)酵速率最慢的L0906菌。最終選取產(chǎn)肽能力強且發(fā)酵速率快的CICC6024菌作為發(fā)酵牛乳產(chǎn)肽的發(fā)酵菌株，發(fā)酵時間為16h。

2.4 不同發(fā)酵時間3株瑞士乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)肽分析

圖4 CICC6024、JCM1120、L0906菌柱在不同發(fā)酵時間的小肽反相液相色譜峰Fig.4 RP-HPLC chromatograms of fermentation products of CICC6024, JCM1120 and L0906 at 0, 4, 8 and 16 h

圖4直觀表明，隨著發(fā)酵時間的延長，小肽峰高度和峰面積都在不斷的提高，反映出16h之前CICC6024、JCM1120、L0906菌株發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)生小肽的含量隨發(fā)酵時間的延長而逐漸增多，并且3株菌小肽峰的個數(shù)也逐漸增多，這也反映了小肽的類型隨發(fā)酵時間的延長逐漸豐富起來。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，CICC6024和JCM1120菌株發(fā)酵牛乳產(chǎn)肽量都在16h處達到最大，其中產(chǎn)酸能力最強的CICC6024菌株其水解度也是最大的，在22h即可達到3%，而這比文獻[9]中報道的乳桿菌的水解度1%～2%要高許多；L0906菌株的發(fā)酵活性較為緩慢，在28h尚未達到頂峰；另外小肽的反相液相色譜峰圖顯示，CICC6024菌株和JCM1120菌株以及L0906菌株的峰都較為復雜而且小肽類型隨發(fā)酵時間增長而逐漸豐富起來。通過比較最后選定CICC6024菌株為后續(xù)實驗所用菌株，發(fā)酵產(chǎn)肽時間定為16h。

功能性發(fā)酵乳制品的開發(fā)有著廣闊的前景，長時間食用發(fā)酵乳制品如干酪、酸奶等對人體的免疫系統(tǒng)有良好的促進作用[10]，而作為此領(lǐng)域研究者，必須選擇那些發(fā)酵能力強的菌株，在選擇發(fā)酵產(chǎn)肽能力強的乳酸菌時往往始于水解度以及產(chǎn)肽量的直接或間接測定[11]，優(yōu)先以產(chǎn)肽能力和水解度為篩選指標可以有效地提高篩選效率。本實驗為后續(xù)實驗篩選出了發(fā)酵菌株CICC6024菌。

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Production Comparison of Small Peptides in Milk Fermented by Different Strains of Lactobacillus helveticus

YIN Jie1，LU Shan-shan1，ZHANG Shao-hui1,2，GAO Yan-ling1，F(xiàn)U Li-na1,2,*
(1. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China；2. Bor S. Luh Food Safety Research Center, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

TS252.1

A

1002-6630(2010)15-0186-04

2009-12-21

國家“863”計劃項目(2008AA10Z329)

殷捷(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵乳制品的免疫活性。E-mail：jack.yin.sjtu@gmail.com

*通信作者：付麗娜(1980—)，女，講師，博士研究生，研究方向為發(fā)酵乳制品的免疫活性。E-mail：fln1980@126.com