劉尊遠(yuǎn)，張 巖，薛 峰

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院麻醉系，山東濰坊 261041；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院麻醉科，山東濰坊 261041；3.山東省濰坊市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濰坊 261041）

圍術(shù)期機(jī)體在創(chuàng)傷刺激下可引起免疫功能的變化，中性粒細(xì)胞（PMN）是機(jī)體免疫反應(yīng)的第一道防線，CD11b在PMN表面的大量表達(dá)在炎癥反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，目前有關(guān)麻醉藥對(duì)CD11b表達(dá)的研究文獻(xiàn)較多，但關(guān)于肌松藥的免疫學(xué)方面研究報(bào)道甚少，本文通過(guò)采用流式細(xì)胞儀分析三種中長(zhǎng)效肌松藥對(duì)成人離體靜脈血中性粒細(xì)胞CD11b表達(dá)的影響，進(jìn)而為肌松藥的免疫學(xué)研究和合理應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

順苯磺酸阿曲庫(kù)銨（批號(hào)：10030713，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國(guó)），哌庫(kù)溴銨（批號(hào)：A78048A，匈牙利吉利大藥廠，匈牙利），維庫(kù)溴銨（批號(hào)：100302.1，浙江仙琚制藥股份有限公司）脂多糖（LPS，批號(hào)：029k4023，Sigma 公司，美國(guó)），F(xiàn)ITC標(biāo)記MouseAnti-HumanCD11b抗體（批號(hào)：4AH110912F，北京四正柏生物科技有限公司），電熱恒溫水溫箱（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠），F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀（Becton Dicknson公司，美國(guó)），可調(diào)定量加液器（上海求精玻璃儀器廠），XW-80A渦旋混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司），LD5-2A型低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），一次性使用負(fù)壓采血器（山東永康公司）。

1.2 受試對(duì)象

年齡 20～40 歲，體重 55～75 kg，ASA Ⅰ級(jí)、無(wú)吸煙史、無(wú)感染及免疫系統(tǒng)疾病、近期（1周內(nèi)）未服用影響免疫功能的藥物，男性和女性各5例。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)分為14組，空白組[K]；靜息無(wú)刺激下藥物各組[J]{順阿曲庫(kù)銨1，2濃度組；哌庫(kù)溴銨1，2濃度組；維庫(kù)溴銨 1，2 濃度組}；脂多糖（LPS）組[L]；刺激下藥物各組[C]｛三種1，2濃度肌松藥分別添加脂多糖組｝。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟與檢測(cè)

取上述抗凝全血，每份血樣均同時(shí)分配于上述各處理組，各組每例加入100 μl全血；而后，空白組[K]及LPS組[L]添加生理鹽水100 μl對(duì)照，其余各組分別加入相應(yīng)濃度藥物100 μl達(dá)到對(duì)應(yīng)終濃度；把上述各組樣品放入37℃恒溫箱避光孵育1.5 h。[L]和[C]下各組加入終濃度為1 μg/ml的脂多糖 100 μl，[K]和[J]下各組添加生理鹽水 100 μl對(duì)照；各樣品繼續(xù)入37℃恒溫箱避光孵育2 h；隨后，取上述樣品加入10 μl FITC標(biāo)記CD11b抗體，室溫避光孵育20 min，加入2 ml紅細(xì)胞裂解液（BD公司，美國(guó)）混勻后避光放置10 min，樣品離心5 min棄上清，沉淀用PBS洗2次，0.5 ml PBS重懸細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)[1-2]。用PMN上CD11b平均熒光強(qiáng)度來(lái)表示CD11b的表達(dá)水平，用CELLQuest軟件進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，F(xiàn)riedman檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，靜息組（前7組）與激活組（后7組）均數(shù)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），靜息組與激活組二者分別進(jìn)行組內(nèi)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較顯示：哌庫(kù)溴銨低濃度組和空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），哌庫(kù)溴銨高濃度組與維庫(kù)溴銨低濃度組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），哌庫(kù)溴銨高濃度組與低濃度租比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。維庫(kù)溴銨低濃度組與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），維庫(kù)溴銨低濃度組與順阿曲庫(kù)銨低濃度組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

分析表明,與空白組比較，低濃度維庫(kù)溴銨和低濃度哌庫(kù)溴銨均可下調(diào)靜息狀態(tài)CD11b的表達(dá)。哌庫(kù)溴銨高低濃度間表達(dá)有差別，但與空白組比較均無(wú)明顯差異。順阿曲庫(kù)銨低濃度組與維庫(kù)溴銨低濃度組有差別，但順阿曲庫(kù)銨兩濃度組與空白組比較均無(wú)明顯差異。三種肌松藥對(duì)LPS激活狀態(tài)下的PMN表面CD11b表達(dá)均無(wú)明顯差異。

表1 各組樣本對(duì)表達(dá)的影響（n=10，±s）Tab.1 Effects of each group on the CD11b expression(n=10,±s)

表1 各組樣本對(duì)表達(dá)的影響（n=10，±s）Tab.1 Effects of each group on the CD11b expression(n=10,±s)

與空白組比較,*P＜0.05；與哌庫(kù)溴銨低濃度比較，▲P＜0.05；與維庫(kù)溴銨低濃度比較，●P＜0.05Compared with blank group,*P＜0.05;compared with low concentration of pipecuronium group,▲P＜0.05;compared with low concentration of vecuronium group,●P＜0.05

組別 濃度（μg/ml） CD11b表達(dá)的平均光密度強(qiáng)度空白組順阿曲庫(kù)銨組哌庫(kù)溴銨組維庫(kù)溴銨組0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 LPS組順阿曲庫(kù)銨+LPS組哌庫(kù)溴銨+LPS組維庫(kù)溴銨+LPS組0.5 0.1 0.5 0.1 0.5 0.1 297.304±15.623 272.132±32.787 300.571±14.320●324.523±24.675▲●262.841±26.722*331.811±92.084 268.429±5.208*810.672±62.232 778.598±51.218 778.925±54.058 765.107±55.833 801.510±50.283 791.032±48.601 813.651±32.233

3 討論

CD11b/CD18是白細(xì)胞整合素亞家族中的一員，CD11b／CD18是 α，β 異二聚體， 以非共價(jià)鍵連接，CD11a、b、c均共用CD18這條β鏈，而CD11b／CD18是中性粒細(xì)胞最主要的整合素局限在白細(xì)胞上表達(dá)，主要分布于PMN、單核-吞噬細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞表面，可參與補(bǔ)體結(jié)合和吞噬調(diào)理，并在PMN和單核細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過(guò)程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而參與免疫炎癥反應(yīng)[3]。有報(bào)道，CD11b表達(dá)上調(diào)還可抑制PMN凋亡[4]。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)CD11b主要表達(dá)于PMN表面，單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞表面僅有少量表達(dá)，進(jìn)一步表明CD11b與中性粒細(xì)胞聯(lián)系密切。

本實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)報(bào)道的微量全血流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定PMN表面 CD11b的表達(dá)，盡可能接近生理全血環(huán)境[1-2]，實(shí)驗(yàn)設(shè)定的三種肌松藥物的兩濃度也基本接近麻醉誘導(dǎo)和維持濃度[5]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)低濃度哌庫(kù)溴銨和維庫(kù)溴銨在靜息狀態(tài)下可抑制CD11b表達(dá)，但對(duì)LPS激活狀態(tài)下的CD11b表達(dá)無(wú)影響，可能與實(shí)驗(yàn)中LPS激活作用過(guò)強(qiáng)、時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)靜息無(wú)LPS刺激狀態(tài)下包括空白組在內(nèi)各組整體均數(shù)普遍較文獻(xiàn)報(bào)道有所抬高，可能是實(shí)驗(yàn)進(jìn)程中采用振蕩器搖勻機(jī)械刺激所致，這與文獻(xiàn)報(bào)道機(jī)械刺激可加速CD11b表達(dá)一致[6]。本研究進(jìn)一步表明：麻醉藥對(duì)CD11b表達(dá)的抑制與PMN所處的狀態(tài)、用藥劑量以及用藥時(shí)機(jī)有關(guān)[1-2]，但藥物與抑制效應(yīng)間無(wú)劑量相關(guān)性，即增加藥量抑制效應(yīng)不會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)[7]。本實(shí)驗(yàn)研究的三種肌松藥是當(dāng)今臨床應(yīng)用最為普遍的三種中長(zhǎng)效非去極化肌松藥，本次小樣本資料研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)前兩種甾體類(lèi)肌松藥可抑制靜息狀態(tài)的PMN表面CD11b的表達(dá)，這是否與肌松藥過(guò)敏反應(yīng)有關(guān)，文獻(xiàn)多數(shù)報(bào)道維庫(kù)溴銨、哌庫(kù)溴銨、順阿曲庫(kù)銨組胺釋放作用很少[8-9]。也有報(bào)道高濃度的順阿曲庫(kù)銨皮內(nèi)實(shí)驗(yàn)可引起風(fēng)團(tuán)反應(yīng)和輕中度肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)[10]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)肌松藥引起的過(guò)敏反應(yīng)與 CD63、CCR3、CD11b 的表達(dá)呈現(xiàn)相關(guān)性[11-12]。CD63 不僅表達(dá)于嗜堿粒細(xì)胞，還表達(dá)于PMN表面并參與PMN活化和內(nèi)皮黏附功能。肌松藥導(dǎo)致的過(guò)敏反應(yīng)推測(cè)可能與圍術(shù)期創(chuàng)傷激活炎癥反應(yīng)導(dǎo)致外周血中細(xì)胞因子釋放增加[13-14]，進(jìn)而影響CD11b、CD63的表達(dá)和激活有關(guān)，但在肌松藥未導(dǎo)致過(guò)敏現(xiàn)象時(shí)CD11b和CD63的表達(dá)有何種相關(guān)尚不清楚，可能有多種中間機(jī)制調(diào)節(jié)其免疫穩(wěn)定性。另外，本研究哌庫(kù)溴銨和維庫(kù)溴銨均屬于甾體類(lèi)肌松藥，順阿曲庫(kù)銨為卞異喹啉類(lèi)，這是否與兩類(lèi)藥物的分子結(jié)構(gòu)基團(tuán)和化學(xué)特性有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究論證。

綜上所述，接近臨床肌松維持濃度的維庫(kù)溴銨和哌庫(kù)溴銨可下調(diào)靜息狀態(tài)離體人靜脈血中性粒細(xì)胞表面CD11b表達(dá)，順阿曲庫(kù)銨對(duì)離體人靜脈血中性粒細(xì)胞表面CD11b表達(dá)無(wú)影響。三種肌松藥對(duì)LPS強(qiáng)刺激下的離體靜脈全血中的CD11b表達(dá)均無(wú)影響。

[1]李新友,屠偉峰,郄文斌,等.瑞芬太尼和異丙酚對(duì)健康成人靜脈血中性粒細(xì)胞 CD1lb 表達(dá)的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,2006,26(9）∶785-789.

[2]Inada T,Taniuchi S,Shingu K,et al.Propofol depressed neutrophil hydrogen peroxide production more than midazolam,whereas adhesion molecule expression was minima1ly affected by both anesthetics in rats with abdominal sepsis[J].Anesth Ana1g,2001,92(2)∶437-441.

[3]龔非力.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京∶科學(xué)出版社,2004∶100-114.

[4]Simon HU.Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation[J].Immunol Rev,2003,193(1)∶101-110.

[5]Miller R.D.米勒麻醉學(xué)[M].曾因明,鄧小明,譯.北京∶北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2006∶494-558.

[6]程衛(wèi)平,張海濤,吳安石.一氧化氮對(duì)人離體中性粒細(xì)胞C11b表達(dá)的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,1998,18(10)∶601-603.

[7]Szekely A,Heindl B,Zahler S,et al.Nonuniform behavior of intravenous anesthetics on postischemic adhesion of neutrophils in the guinea pig heart[J].Anesthesia&Analgesia,2000,90(6)∶1293-1300.

[8]Naguib M,Samarkandi AH,Bakhamees HS,et al.Histamine-release haemodynamic changes produced by rocuronium,vecuronium,mivacurium,atracurium and tubocurarine[J].Br J Anaesth,1995,75(5)∶588-592.

[9]劉威,聞大翔,杭燕南,等.四種中時(shí)效非去極化肌松藥組胺釋放作用的研究[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2003,23(5)∶445-448.

[10]Levy JH,Gottge M,Szlam F,et al.Weal and flare responses to intradermal rocuronium and cisatracurium in humans[J].Br J Anaesth,2000,85(6)∶844-849.

[11]Monneret G,Benoit Y,Debard AL,et al.Monitoring of basophil activation using CD63 and CCR3 in allergy to muscle relaxant drugs[J].Clinical Immunology,2002,102(2)∶192-199.

[12]Kinhult J,Egesten A,Uddman R,et al.PACAP enhances the expression of CD11b,CD66b and CD63 in human neutrophils[J].Peptides,2002,23(10)∶1735-1739.

[13]Pillay J,Hietbrink F,Koenderman L,et al.The systemic inflammatory response induced by trauma is reflected by multiple phenotypes of blood neutrophils[J].Injury,2007,38(12)∶1365-1372.

[14]宋新明,王吉甫,趙繼宗,等.手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)炎性細(xì)胞因子的影響[J].廣東醫(yī)藥,1999,20(3)∶169-171.