楊帥，李開通，張藝軒，曹陽，石鉞

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所,北京100193）

點柄乳牛肝菌中麥角甾醇的分離鑒定及含量測定

楊帥，李開通，張藝軒，曹陽，石鉞*

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所,北京100193）

研究點柄乳牛肝菌的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)其主要指標(biāo)性成分，建立其含量測定方法。將點柄乳牛肝菌用溶劑提取，硅膠柱分離，通過波譜技術(shù)對化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。采用HPLC法，色譜柱為Kromasil C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流動相為純甲醇；檢測波長為284 nm。結(jié)果表明，麥角甾醇為點柄乳牛肝菌的指標(biāo)性成分，麥角甾醇在0.64 μg~12.80 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，r=0.9992，麥角甾醇的平均回收率均為98.19%，RSD為2.04%。

點柄乳牛肝菌；麥角甾醇；分離；高效液相色譜法

Abstract：An index compound,ergosterol,in the extract of Suillus granulatus was isolated by column chromatography and its structure was elucidated by spectroscopic analysis.An HPLC method was established for the determination of ergosterol in the extract of Suillus granulatus.The determination was carried out with Kromasil C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）,using pure methanol as mobile phase and detected at the wavelength of 284 nm.The results showed that a good linear relationship in the range of 0.64 μg-12.80 μg（r=0.9992）was obtained for ergosterol.The average recovery was 98.19%,RSD was 2.04%.The method is simple,accurate,and with a good reproducibility which can be used to control the quality of the extract of Suillus granulatus.

Key words:Suillus granulatus;Ergosterol;isolation;HPLC

點柄乳牛肝菌（Suillus granulatus(Fr.)Kuntze）屬牛肝菌目乳牛肝菌科真菌，民間食用已久，廣泛分布于云南、河北、貴州、吉林等省區(qū)。在西歐各國被推崇為著名的營養(yǎng)食品，是菌類中換匯率較高的暢銷商品。牛肝菌營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是深受歡迎的著名食用菌，具有清熱解煩、養(yǎng)血和中、助消化、追風(fēng)散寒、補虛提神之功效；民間常用于治療感冒咳嗽，食積腹脹，脾虛神疲及婦女白帶過多等癥；也有驅(qū)風(fēng)解毒、消腫功效的記載[1]。曾有文獻(xiàn)報道，該菌子實體CH2Cl2提取物對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌有顯著的抑制活性，對腫瘤細(xì)胞也有一定的抑制活性[2-3]；在試驗中發(fā)現(xiàn)，該菌子實體乙醇提取物具有良好的通便作用。為了弄清該真菌的生物活性成分，同時對該菌乙醇提取物建立穩(wěn)定可行的質(zhì)量控制方法，對其子實體進(jìn)行了化學(xué)成分研究，發(fā)現(xiàn)麥角甾醇可作為指標(biāo)性成分，用于控制點柄乳牛肝菌及其提取物的質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Fisher-Johns顯微熔點測定儀（未校正）；Varian-300型核磁共振儀；Agilent1100-API3200液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（正離子模式）；Waters 600型高效液相色譜儀（Waters 600系統(tǒng)，Waters 2487檢測器，Millennium32色譜工作站）；METTLER AB135-S型十萬分之一電子天平；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器。

薄層層析和柱層析用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品；含量測定用甲醇為色譜純，其它化學(xué)試劑均為分析純。真菌樣品采自于云南，由首都師范大學(xué)微生物教研室范黎博士鑒定為牛肝菌目乳牛肝菌科點柄乳牛肝菌（Suillus granulatus(Fr.)Kuntze），樣品存放于本實驗室。

2 方法

2.1 提取分離

點柄乳牛肝菌冷凍干燥品202 g，用95%乙醇加熱回流兩次，每次1 h，合并提取液，回收乙醇，濃縮液濕法拌樣，硅膠柱層析（160目~200目），經(jīng)石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫，分別得到6部分洗脫物，其中第2部分中有大量白色結(jié)晶析出，經(jīng)薄層展開顯示為同一化合物，合并，得單體M10。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

對分離得到的化合物進(jìn)行MS分析、1H-NMR和13C-NMR圖譜分析鑒定，確定化合物的結(jié)構(gòu)。

2.3 測定色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流動相：純甲醇；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：284 nm。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取麥角甾醇對照品6.40 mg，置10 mL棕色量瓶中，加無水乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL中含麥角甾醇0.64 mg。

2.5 供試品溶液制備

精密稱取點柄乳牛肝菌乙醇提取物0.1041 g，置50 mL具塞三角瓶中，精密加入無水乙醇10 mL，稱定重量，超聲處理20 min使溶解，冷卻至室溫，再稱定重量，用無水乙醇補足減失的重量，過濾，濾液作為供試品溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

單體M10為白色針晶（乙醇），mp 148℃。MS、1HNMR和13C-NMR波譜數(shù)據(jù)如下：

上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4-5]基本一致，故該化合物被鑒定為麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇（麥角甾醇）。

3.2 含量測定系統(tǒng)適用性考察

在測定色譜條件下，供試品中麥角甾醇與其它組分分離度良好（見圖1），利于含量測定，其柱效（n）及分離度（R）計算如下：

上述兩式中：tR為保留時間（以分鐘或長度計，但應(yīng)取相同單位）；Wh/2為半高峰寬；tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；W1及W2為此相鄰兩峰的縫寬。

根據(jù)計算結(jié)果，確定含量測定時的理論板數(shù)按麥角甾醇峰計不得低于3000。

3.3 線性關(guān)系考察

分別精密量取對照品溶液 1、5、10、15、20 μL 注入液相色譜儀中，測定，以麥角甾醇進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算麥角甾醇的回歸方程為：Y=988788X－192569，r=0.9992，表明麥角甾醇在0.64 μg~12.80 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 點柄乳牛肝菌乙醇提取物中麥角甾醇HPLC測定圖譜Fig.1 The chromatogram of extract from Suillus granulatus

3.4 精密度試驗考察

精密吸取對照品溶液，按2.3項下色譜條件進(jìn)行測定，重復(fù)5次，每次進(jìn)樣10 μL，測得麥角甾醇峰面積積分值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.22%，表明儀器精密度較高。

3.5 穩(wěn)定性試驗考察

精密量取供試品溶液，在 0、2、4、6、8、12 h 各進(jìn)樣10 μL，測得麥角甾醇峰面積積分值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.97%，說明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 重復(fù)性試驗考察

精密稱取同一批供試品5份（批號：20070412），每份約0.1 g，同上處理，按2.3項下色譜條件測定5次，每次進(jìn)樣10 μL，測得麥角甾醇含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.38%，表明方法重復(fù)性較好。

3.7 回收率試驗考察

采用加樣回收法，取已知含量的供試品6份（批號：20070412），每份約 0.05 g，精密稱定，分別精密加入濃度為0.64 mg/mL的麥角甾醇對照品溶液2.0 mL，置50 mL具塞三角瓶中，按2.5項方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件進(jìn)行測定，每次進(jìn)樣10 μL，計算回收率，結(jié)果麥角甾醇的平均回收率為98.19%，RSD為2.04%，說明本法回收率良好，方法可行。

3.8 樣品測定

取4批點柄乳牛肝菌乙醇提取物，每批稱取約0.1 g，精密稱定，按2.5項下方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件進(jìn)行測定，每批樣品測定3次，每次進(jìn)樣10 μL，按線性方程計算麥角甾醇含量，結(jié)果見表1。

表1 點柄乳牛肝菌乙醇提取物中麥角甾醇含量測定結(jié)果Table 1 The Contents of Ergosterol in the extracts from Suillus granulatus

4 結(jié)論

麥角甾醇是真菌類的特征甾醇，具有增強人體抗病和預(yù)防感冒之功效，經(jīng)常食用可預(yù)防、治療血鈣代謝障礙而導(dǎo)致的傴僂病，還可防止機體各種黏膜炎及皮膚炎。它是脂溶性VD的前體，經(jīng)紫外線光化學(xué)反應(yīng)生成VD，VD在調(diào)節(jié)生命代謝功能上有重要作用。本實驗從柄乳牛肝菌中分離得到麥角甾醇，并對化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。采用高效液相色譜法，建立了點柄乳牛肝菌主要指標(biāo)性成分麥角甾醇的含量測定方法，方法學(xué)考察，麥角甾醇在0.64 μg~12.80 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率等試驗符合相關(guān)要求，且操作簡便快速，可以作為點柄乳牛肝菌及其提取物的質(zhì)量控制方法。

[1]袁明生,孫佩瓊.四川覃菌[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1995：239-311

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Isolation and Determination of Ergosterol from Suillus Granulatus

YANG Shuai,LI Kai-tong,ZHANG Yi-xuan,CAO Yang,SHI Yue*
（Institute of Medicinal Plant Development，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193,China）

2009-09-03

楊帥（1983—），女（漢），碩士研究生，研究方向：中藥藥效成分分析。

*通信作者：石鉞（1963—），男（漢），研究員，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量控制。