楊秋明,郭彩華,蔡慧農(nóng),王璋

1(集美大學(xué)生物工程學(xué)院,福建廈門(mén),361021) 2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100027)

耐鹽酵母固定化方法的初步研究＊

楊秋明1,郭彩華1,蔡慧農(nóng)1,王璋2

1(集美大學(xué)生物工程學(xué)院,福建廈門(mén),361021) 2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京,100027)

以不同的固定化材料對(duì)耐鹽酵母進(jìn)行固定化,從中選擇適宜的固定化載體。采用正交實(shí)驗(yàn)確定了適宜固定化的條件,并采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行極差和方差分析。結(jié)果表明,海藻酸鈉-氯化鈣固定化耐鹽酵母優(yōu)于瓊脂、明膠固定化耐鹽酵母,當(dāng)海藻酸鈉濃度4 g/100 mL,CaCl2濃度為1.4 mol/L,發(fā)酵溫度為28℃時(shí),耐鹽酵母的固定化效果較好。

耐鹽酵母,固定化,載體,真正發(fā)酵力

固定化技術(shù)是現(xiàn)代生物工程領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一,它是指利用化學(xué)或物理手段將游離的細(xì)胞(微生物)或酶,定位于限定的空間區(qū)域并使其保持活力并可反復(fù)使用的一種基本技術(shù)[1]。

由于固定化酵母克服了傳統(tǒng)游離酵母發(fā)酵工藝中酵母與產(chǎn)品分離困難、易流失、影響產(chǎn)品質(zhì)量等問(wèn)題,且具有生長(zhǎng)快、反應(yīng)迅速、抗污染能力強(qiáng)、可連續(xù)使用、產(chǎn)物分離方便等優(yōu)點(diǎn),然而到目前為止,尚無(wú)一種可用于所有種類(lèi)的微生物細(xì)胞固定化的通用方法,因此,對(duì)某一特定的微生物細(xì)胞來(lái)說(shuō),必須選擇其合適的固定化方法和條件[1]。

日本于1982年開(kāi)始研究把固定化細(xì)胞發(fā)酵用于醬油釀造,以低鹽發(fā)酵液為底物,用海藻酸鈉、聚乙稀醇或陶瓷制品為載體,分別固定耐鹽酵母菌和乳酸菌,以提高醬醪中成味物質(zhì)的含量,國(guó)內(nèi)也有類(lèi)似的研究[2]。本論文主要利用包埋法和共價(jià)結(jié)合法,研究三種載體固定化耐鹽酵母的固定化效果,從中選擇一種適宜的固定化載體,通過(guò)這種固定化載體研究分析載體濃度、固定化溫度對(duì)固定化耐鹽酵母發(fā)酵性能的影響,分析固定化酵母與游離酵母發(fā)酵性能的區(qū)別,優(yōu)化出耐鹽酵母細(xì)胞的固定化條件,為酵母細(xì)胞的固定化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

耐鹽酵母拉頂菌名JM01(廈門(mén)淘化大同調(diào)味品公司提供的后熟醬醪中分離得到的酵母)。

1.1.2 培養(yǎng)基

麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基(McCLary)(g/L):葡萄糖10.0,KCl 1.8,酵母膏2.5,醋酸鈉8.2,NaCl 100.0,瓊脂粉15.0,pH自然。

YPD液體培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0,酵母粉10.0,蛋白胨20.0,食鹽160.0 pH自然。

高糖YPD培養(yǎng)基:在原有YPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加5%葡萄糖,5%的蔗糖。

以上培養(yǎng)基滅菌條件均為121℃,20 min。

1.1.3 試劑

酵母粉購(gòu)買(mǎi)于OXOLD公司,蛋白胨、葡萄糖購(gòu)買(mǎi)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,牛肉膏購(gòu)買(mǎi)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;純化瓊脂粉購(gòu)買(mǎi)于上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司(分裝);海藻酸鈉購(gòu)買(mǎi)于青島洋峰海藻有限公司;食鹽、蔗糖食品級(jí);其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 儀器

S W-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司),YXQ-LS-30SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),恒溫培養(yǎng)搖床(上海智城分析儀器制造有限公司),生化培養(yǎng)箱(寧波萊?？萍加邢薰?,DBMB5-223JP2-5型數(shù)碼顯微鏡(Motic顯微鏡),721型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。一次性注射器:醫(yī)用級(jí),市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐鹽酵母種子培養(yǎng)液的制備

挑取新鮮斜面菌種1環(huán),接入裝有30 mL YPD培養(yǎng)基的300 mL錐形瓶中,28℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。取濕菌體細(xì)胞,用生理鹽水配成10 g/100 mL菌懸液(以濕菌體計(jì))。

1.2.2 耐鹽酵母細(xì)胞的包埋固定化

(1)瓊脂凝膠固定化細(xì)胞的制備:4.0 g/100 mL瓊脂溶液滅菌后冷卻至45℃,以4∶1的比例加入菌懸液,混合均勻,倒入無(wú)菌平皿中待凝,待充分凝固后將其切成大小為3×3×3 mm3的塊狀,用無(wú)菌水洗滌。按10%(v/v)接種量將固定化耐鹽酵母細(xì)胞置于200 mL YPD培養(yǎng)基中,在28℃下發(fā)酵 5d。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)測(cè)定固定化顆粒的強(qiáng)度、耗糖量及透光率。同時(shí),以相同接種量的游離細(xì)胞的發(fā)酵情況作為對(duì)照相比較。

(2)海藻酸鈉凝膠固定化細(xì)胞的制備:4.0 g/100 mL海藻酸鈉溶液滅菌后冷卻至45℃,以4∶1的比例加入菌懸液,混合均勻,倒入一次性注射器外套,通過(guò)直徑為2.5-3.0 mm的小孔,以恒定的速度滴到盛有10%CaCl2溶液(已滅菌)的平皿中制成凝膠珠。浸泡30 min后,將凝膠珠轉(zhuǎn)入300 mL錐形瓶中,用無(wú)菌去離子水洗滌。按10%(v/v)接種量將固定化耐鹽酵母細(xì)胞置于200 mL YPD培養(yǎng)基中,在28℃下發(fā)酵5 d。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)測(cè)定固定化顆粒的強(qiáng)度、耗糖量及透光率。同時(shí),以相同接種量的游離細(xì)胞的發(fā)酵情況作為對(duì)照相比較。

(3)吸取10 mL 10%菌懸液加入25 mL濃度為2 g/100 mL的明膠液中,混合均勻,倒入無(wú)菌平皿中,在0-5℃凍結(jié)后,切成3×3×3 mm3小塊,再浸入1.5%戊二醛中,室溫下交聯(lián)3 h,將顆粒轉(zhuǎn)入300 mL錐形瓶中,用無(wú)菌去離子水洗滌3次,按10%(v/v)接種量將固定化耐鹽酵母細(xì)胞置于200 mL YPD培養(yǎng)基中,在28℃下發(fā)酵5 d。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)測(cè)定固定化顆粒的強(qiáng)度、耗糖量及透光率。同時(shí),以相同接種量的游離細(xì)胞的發(fā)酵情況作為對(duì)照相比較。

1.2.3 耐鹽酵母固定化條件的選擇

以氯化鈣濃度、海藻酸鈉濃度和發(fā)酵溫度為試驗(yàn)因素,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),各因素的水平見(jiàn)表1。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

用無(wú)菌水洗滌凝膠珠后,按10%(v/v)接種量將固定化耐鹽酵母細(xì)胞置于200 mL高糖YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵8 d。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)測(cè)定真正發(fā)酵力(耗糖量)。用SPSS大型統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行極差和方差分析[3]。

1.2.4 固定化酵母與游離酵母發(fā)酵性能的比較

(1)固定化酵母的發(fā)酵試驗(yàn):將海藻酸鈉固定化后的耐鹽酵母凝膠珠按10%(v/v)接種量置于200 mL高糖YPD培養(yǎng)基中,在28℃下靜止培養(yǎng)。

發(fā)酵至規(guī)定時(shí)間后,濾出固定化耐鹽酵母,測(cè)定耗糖量。將發(fā)酵液倒入蒸餾瓶中蒸餾,截取100 mL蒸餾液,用酒精計(jì)測(cè)量乙醇體積分?jǐn)?shù)和溫度,并校正為20℃下的乙醇體積分?jǐn)?shù)。

(2)游離酵母的發(fā)酵試驗(yàn):將耐鹽酵母菌懸液10%(v/v)接種量直接添加于200 mL高糖YPD培養(yǎng)基中,在28℃下靜止培養(yǎng)后測(cè)定耗糖量及酒精度。

1.2.5 分析測(cè)定項(xiàng)目及方法

(1)固定化耐鹽酵母機(jī)械強(qiáng)度的測(cè)定[4]:取30個(gè)固定化耐鹽酵母顆粒,測(cè)定使其變形一半時(shí)所需的壓力。

(2)乙醇生成量的測(cè)定:蒸餾后用酒精計(jì)測(cè)量[5]。

(3)糖含量的測(cè)定:用斐林試劑法測(cè)定發(fā)酵液的糖度[6]。

真正發(fā)酵力=(發(fā)酵液初始糖度-發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液殘?zhí)嵌?/發(fā)酵液初始糖度

(4)細(xì)胞固定效果測(cè)定:于波長(zhǎng)650 nm下,用721型分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的透光率確定。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化載體的選擇

固定化顆粒的強(qiáng)度是影響其應(yīng)用的重要因素。從固定化強(qiáng)度來(lái)分析,海藻酸鈣固定化的效果優(yōu)于瓊脂和明膠的固定化,見(jiàn)表2。比較海藻酸鈣固定法和瓊脂固定法,由于海藻酸鈣中大量的陽(yáng)離子Ca2+與酵母細(xì)胞壁及膜上的陰離子集團(tuán)結(jié)合緊密,使細(xì)胞不易逸出。而瓊脂為非極性大分子多糖,其凝膠環(huán)境不利于和酵母菌結(jié)合,使得相當(dāng)一部分細(xì)胞逸出凝膠,因而海藻酸鈣固定化優(yōu)于瓊脂固定化的效果。

使用固定化耐鹽酵母時(shí),酵母細(xì)胞應(yīng)牢固地包埋在凝膠中,避免細(xì)胞游離逸出,使發(fā)酵液保持澄清,容易分離。在發(fā)酵液中,游離的細(xì)胞愈多,則發(fā)酵液的透光率越低。從透光率分析是海藻酸鈣的包埋效果最好,瓊脂其次,明膠的包埋效果最差。從真正發(fā)酵力來(lái)看海藻酸鈣固定化的發(fā)酵力比瓊脂和明膠固定化的要小,說(shuō)明細(xì)胞游離逸出較慢。綜合考慮,選擇海藻酸鈣作為固定耐鹽酵母的載體。

表2 不同固定化方法的固定效果比較

2.2 耐鹽酵母細(xì)胞固定化條件分析

海藻酸鈉是從海藻提取獲取的藻酸鹽,為 D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的線性共聚物,多價(jià)陽(yáng)離子(如 Ca2+)可誘導(dǎo)凝膠。Ca2+是決定海藻酸鈣固定化酵母機(jī)械強(qiáng)度的重要因素,隨著 Ca2+濃度的增加,固定化酵母的強(qiáng)度增加,適宜的海藻酸鈉的濃度使凝膠相對(duì)滲透性能好,有利于底物的進(jìn)入和產(chǎn)物排出,因此,利于耐鹽酵母細(xì)胞的發(fā)酵作用。

從極差分析結(jié)果可以看出,三個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)固定化耐鹽酵母真正發(fā)酵力的影響主次順序?yàn)楹Ｔ逅徕c濃度 B>氯化鈣濃度 A>發(fā)酵溫度 C,即海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酵母的發(fā)酵性能影響最大,其次是氯化鈣濃度,發(fā)酵溫度影響最小。

表3 固定化條件的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果極差分析

表4 固定化條件的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果方差分析

表5 方差分析表

通過(guò)極差和方差分析可以看出影響固定化耐鹽酵母發(fā)酵力的因素——海藻酸鈉濃度 B 、氯化鈣濃度A、發(fā)酵溫度C,其最優(yōu)的組合為 A2B2C2或A2B2C1,即氯化鈣濃度為1.4 mol/L,海藻酸鈉濃度為4 g/100 mL,發(fā)酵溫度為30℃或28℃時(shí),耐鹽酵母的固定化效果最為理想。從實(shí)際操作和經(jīng)濟(jì)角度綜合考慮,發(fā)酵溫度選取28℃為好。

2.3 固定化耐鹽酵母與游離耐鹽酵母發(fā)酵性能的比較

固定化耐鹽酵母和游離耐鹽酵母在28℃下發(fā)酵21 d的耗糖變化見(jiàn)圖1,發(fā)酵終了時(shí),相應(yīng)的乙醇生成量及殘?zhí)橇恳?jiàn)表6。

圖1 固定化耐鹽酵母與游離耐鹽酵母發(fā)酵特性曲線

表6 固定化耐鹽酵母與游離耐鹽酵母產(chǎn)乙醇能力及殘?zhí)橇康谋容^

耐鹽酵母有延遲發(fā)酵的特性,對(duì)蔗糖的利用較遲緩,所以試驗(yàn)中以葡萄糖為主要碳源。游離耐鹽酵母發(fā)酵時(shí),需要有較長(zhǎng)的適應(yīng)期和增殖期,因此,其發(fā)酵速度較慢,如圖1所示,發(fā)酵終結(jié)時(shí),殘?zhí)橇繛?.25 g/100 mL,而乙醇量為5.6%(v/v),在正常發(fā)酵過(guò)程中,由于產(chǎn)物的積累,底物的消耗,大大的改變了生長(zhǎng)環(huán)境,因此,余下的4.25%(w/v)的糖很難發(fā)酵。而固定化的耐鹽酵母,由于其酵母集中,又相對(duì)處于比較低鹽的環(huán)境,因而適應(yīng)期就大大縮短,發(fā)酵速度有明顯的提高多,發(fā)酵終結(jié)時(shí),殘?zhí)橇繛?.36 g/100 mL。特別是在發(fā)酵前期,即發(fā)酵前5 d,這主要是因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞活性高,底物供應(yīng)充足,產(chǎn)物濃度很低。因此,發(fā)酵速度較快。

3 結(jié)論

比較海藻酸鈣、瓊脂、明膠固定化效果,對(duì)耐鹽酵母來(lái)說(shuō),海藻酸鈣的固定化效果最為理想。水平正交試驗(yàn)表明影響固定化耐鹽酵母真正發(fā)酵力因素的主次順序?yàn)楹Ｔ逅徕c濃度B>氯化鈣濃度A>發(fā)酵溫度C,其優(yōu)化的條件為氯化鈣濃度1.4 mol/L,海藻酸鈉濃度4%(w/v),發(fā)酵溫度為28℃時(shí)。固定化耐鹽酵母的發(fā)酵速度較游離耐鹽酵母快,產(chǎn)醇效率固定化耐鹽酵母較游離耐鹽酵母高0.5%。

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ABSTRACTIn order to get the best carrier,we used different materials to immobilize the salt-tolerant yeast.The optimalimmobilization parameterswere studied by orthogonal experiments,and range analysis and variance analysis were done by using SPSS.The final result showed the sodium alginate and calcium chloride were better than agar and gelatin in immobilization of the salt-resistance yeast.The optimum conditionswere the concentration of sodium alginate4g/100 mL,calcium chloride 1.4 mol/L,at 28℃.Under this condition,the effect of immobilization was better.

Key wordssalt-resistance yeast,immobilization,carrier,real fermenting ability

Prel im inary Research on the I mmobilization of Salt-tolerantYeast

Yang Qiu-ming1,Guo Cai-hua1,Cai Hui-nong1,Wang Zhang2
1(College of Biotechnology,JimeiUniversity,Xiamen 361021,China)
2(China National Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027,China)

實(shí)驗(yàn)師(蔡慧農(nóng)教授為通訊作者)。

＊廈門(mén)市科技項(xiàng)目資助

2009-12-16,改回日期:2010-02-01