王界永，高署，李見春，董海軍，姜威，石和鵬（.合肥合源醫(yī)藥科技有限公司，合肥市0088；.北京福瑞康正醫(yī)藥技術(shù)研究所，北京市 0009；.揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司，北京市 006）

鹽酸非索非那定是特非那定在人體的活性代謝產(chǎn)物，是組胺H1-受體拮抗藥，無抗膽堿和抗腎上腺素受體作用，屬于無鎮(zhèn)靜作用的第2代抗組胺藥[1]，用于治療季節(jié)性過敏性鼻炎及慢性特發(fā)性蕁麻疹，具有很好的臨床治療效果，且無催眠等中樞神經(jīng)不良反應(yīng)[2]。本研究建立了高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定健康人體內(nèi)非索非那定的血藥濃度，并以江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的鹽酸非索非那定片為參比制劑，研究揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的鹽酸非索非那定口腔崩解片的人體相對生物利用度并評價(jià)其生物等效性。

1 材料

1.1 儀器

Finnigan TSQ Quantum Discovery Max型LC-MS/MS聯(lián)用儀，包括ESI離子源、Xcalibur1.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國菲尼根質(zhì)譜公司）；XS105分析天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）；TGL-16H平衡離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；DZG-303A純水機(jī)（臺(tái)灣艾柯儀器廠）。

1.2 試藥

鹽酸非索非那定對照品（北京福瑞康正醫(yī)藥技術(shù)研究所，含量：99.8%）；磷酸可待因?qū)φ掌罚ㄖ袊幤飞镏破窓z定所，批號(hào)：171203-200303）；受試制劑：鹽酸非索非那定口腔崩解片（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司，規(guī)格：60 mg，批號(hào)：2007051501）；參比制劑：鹽酸非索非那定片（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：60 mg，批號(hào)：060905）；甲醇、甲酸均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)方案

選取20名健康男性志愿者，年齡19～24歲，體質(zhì)量55～69 kg。無煙、酒嗜好，無神經(jīng)系統(tǒng)、精神異常及代謝異常等病史，血尿常規(guī)、肝腎功能及心電圖等檢查均正常，身體狀況良好。受試前2周至整個(gè)試驗(yàn)期間禁煙、酒和禁服其它任何藥物。受試者均志愿簽署知情同意書，試驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。采用按體質(zhì)量隨機(jī)交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。受試者按隨機(jī)原則分成2組，洗脫期為1周。20名受試者于清晨7∶00分別空腹口服受試制劑或參比制劑60 mg。受試制劑在受試者飲用200 mL溫開水后置于舌上，溶解或崩解后借吞咽動(dòng)作入胃；參比制劑用200 mL溫開水送服。服藥2 h后方可再飲水，4 h后統(tǒng)一進(jìn)食清淡飲食。服藥及取血期間均留在Ⅰ期臨床病房觀察。

2.2 血樣采集

服藥前取空白血，服藥后分別于0.08、0.17、0.33、0.5、0.75、1、2、3、4、6、12、24、48、72 h時(shí)從志愿者肘靜脈取血3 mL置抗凝管中，靜置30 min，4 000 r·min－1離心，取血漿1 mL，－20 ℃冰箱貯存，用于血藥濃度檢測。

2.3 血樣處理

精確量取血漿100 μL，加入740 ng·mL－1可待因內(nèi)標(biāo)液10 μL，渦旋30 s，加入甲醇300 μL，渦旋3 min，14 000 r·min－1離心10 min，取上清液，再次離心5 min，進(jìn)樣10 μL分析。

2.4 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Synergi POLAR-80R（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶水（含0.1%甲酸）＝85∶15；流速：50 μL·min－1；柱溫：30℃。

ESI離子源；噴霧電壓：4.7 kV；毛細(xì)管溫度：320℃；Skimmer offset：－8 V；鞘氣壓：35；輔助氣壓：4；正離子方式檢測；掃描方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）；用于定量的非索非那定m/z：母離子502.5，子離子170.9，碰撞能40 V；內(nèi)標(biāo)可待因m/z：母離子300.1，子離子165.1，碰撞能38 V；掃描時(shí)間：0.5 s。

2.5 方法專屬性

量取混合空白血漿100 μL，按“2.3”項(xiàng)下方法自“渦旋30 s”起操作，得色譜圖1A；取688 ng·mL－1的鹽酸非索非那定對照品溶液10 μL，加入空白血漿100 μL中，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，得色譜圖1B；取20號(hào)受試者第2周期口服受試制劑0.5 h后的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，得色譜圖1C。結(jié)果表明，非索非那定和內(nèi)標(biāo)可待因的保留時(shí)間分別約為4.4、3.3 min，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾非索非那定和內(nèi)標(biāo)可待因的測定。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與定量下限考察

圖1 液-質(zhì)色譜圖Fig 1HPLC-MS/MS chromatogram

精密量取不同濃度的非索非那定對照品溶液各10 μL，加入空白血漿100 μL，配制成非索非那定血藥濃度分別為0.688、1.72、6.88、18、68.80、180、258 ng·mL－1的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，記錄待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積，以待測物濃度（Y）為縱坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（X）為橫坐標(biāo)，用加權(quán)法（W＝1/X2）進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程為：Y＝23.278X+0.246（r＝0.998 0，n＝3）。結(jié)果表明，非索非那定血藥濃度在0.688～258 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。血漿中非索非那定定量下限為0.688 ng·mL－1（S/N＞10）。

2.7 提取回收率試驗(yàn)

取空白離心管，精密加入不同濃度的非索非那定對照品溶液各10 μL，再加入空白血漿100 μL，配制成非索非那定低、中、高（1.72、18、180 ng·mL－1）3種濃度的血漿樣品各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，記錄非索非那定藥物峰面積As（H）與內(nèi)標(biāo)可待因峰面積Ai（H）；另取離心管加入空白血漿100 μL，加入甲醇300 μL，渦旋3 min，14 000 r·min－1離心10 min，取上清液，加入不同濃度的非索非那定對照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液（740 ng·mL－1可待因）各10 μL，配制成相同濃度樣品，進(jìn)樣10 μL分析，記錄非索非那定藥物峰面積As（D）和內(nèi)標(biāo)可待因峰面積Ai（D），每一濃度進(jìn)行3樣本分析，計(jì)算提取回收率（%）＝As（H）/As（D）×100%，結(jié)果見表1。

表1 提取回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝3）Tab1The results of extraction recovery and precision tes（t±s，n＝3）

表1 提取回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝3）Tab1The results of extraction recovery and precision tes（t±s，n＝3）

加入濃度/ng·mL－1 1.72±s/ng·mL－1日內(nèi)精密度實(shí)測濃度/ng·mL－1 1.77 1.45 1.72 15.53 18.89 16.94 189.31 163.35 172.32 x/%102.91 84.30 100.00 86.28 104.94 94.11 105.17 90.75 95.73 x日間精密度實(shí)測濃度/ng·mL－1 1.68 1.67 1.63 16.14 17.45 16.50 175.35 206.98 168.25 x RSD/%回收率/%±s/%RSD/%1.65±0.11 18 6.790.73±4.925.4 16.91±1.17 180/%97.67 97.09 94.77 89.67 96.94 91.67 97.42 114.99 93.47 6.989.10±8.039.0 179.26±16.179.0 89.30 86.68 96.20 80.84 89.59 96.86 88.56 87.58 85.57 87.23±1.521.8

2.8 精密度試驗(yàn)

按“2.7”項(xiàng)下方法配制非索非那定低、中、高3種濃度的血漿樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，每一濃度進(jìn)行3樣本分析，連續(xù)測定2 d，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血漿樣品的濃度。結(jié)果日內(nèi)和日間的RSD均小于15%，符合生物樣本測定的要求，詳見表1。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.7”項(xiàng)下方法配制非索非那定低、中、高3種濃度的血漿樣品，共7份，每一份樣品進(jìn)行3樣本分析。4份按“2.3”項(xiàng)下方法操作，在室溫下放置0、4、8、23 h后進(jìn)樣分析，考察處理后的血漿樣品在室溫條件下的穩(wěn)定性；1份在室溫下放置9 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，考察藥物在血漿中的室溫穩(wěn)定性；1份在－20℃冰箱反復(fù)凍融3次后，再按“2.3”項(xiàng)下方法操作，考察血漿樣品反復(fù)凍融穩(wěn)定性；1份在－20℃冰箱冷凍21 d后，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，考察血漿樣品長期冷凍穩(wěn)定性。結(jié)果各穩(wěn)定性RSD均小于15%，表明處理后的血漿樣品中非索非那定及含藥血漿樣品在室溫、反復(fù)凍融以及長期冷凍條件下的穩(wěn)定性均較好。

2.10 藥-時(shí)曲線

20名健康志愿者隨機(jī)交叉口服60 mg鹽酸非索非那定口腔崩解片和鹽酸非索非那定片后，用LC-MS/MS法測得不同時(shí)間的非索非那定平均藥-時(shí)曲線。20名受試者口服受試制劑與參比制劑60 mg后平均藥-時(shí)曲線見圖2。

圖2 20名受試者口服受試制劑與參比制劑60 mg后平均藥-時(shí)曲線Fig 2 Mean concentration-time curves of fexofenadine in 20 healthy volunteers after oral administration of 60 mg test and reference tablets

2.11 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)及生物等效性評價(jià)

本試驗(yàn)采用DAS ver 2.1軟件計(jì)算單劑量給藥后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0～72、AUC0～∞和Cmax等。20名受試者口服受試制劑與參比制劑60 mg后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2。經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行藥物間、周期間、個(gè)體間的三因素方差分析，再以雙向單側(cè)t檢驗(yàn)進(jìn)行等效性判斷。結(jié)果，鹽酸非索非那定口腔崩解片AUC0～72和AUC0～∞的90%置信區(qū)間分別為93.2%～121.1%和93.2%～120.9%，均在80%～125%范圍內(nèi)；Cmax的90%置信區(qū)間為94.5%～113.0%，在70%～143%范圍內(nèi)。藥物間、周期間、個(gè)體間方差分析結(jié)果顯示，2種制劑在藥物間和周期間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2種制劑在個(gè)體間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。tmax采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果P＞0.05，表明2種制劑在吸收程度和吸收速度上具有生物等效性。另根據(jù)公式：相對生物利用度（F）%＝AUC0～t（受試制劑）/AUC0～t（參比制劑）×100%計(jì)算鹽酸非索非那定口腔崩解片的相對生物利用度。結(jié)果F值為（112±36）%，在80%～125%內(nèi)，符合相對生物利用度的要求。

3 討論

本試驗(yàn)經(jīng)過摸索確定了直接用甲醇沉淀去蛋白的LC-MS/MS法測定血漿中非索非那定的含量，表明該血樣處理方法相對文獻(xiàn)報(bào)道[3，4]具有操作更簡便、重復(fù)性好、應(yīng)用性更強(qiáng)的優(yōu)勢。

表2 20名受試者口服受試制劑與參比制劑60 mg后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab2 Pharmacokinetic parameters of fexofenadine in 20 healthy volunteers after oral administration of 60 mg test and reference tablets

口腔崩解片是根據(jù)口腔的生理解剖特點(diǎn)設(shè)計(jì)的一種特殊片劑，不用水或用極少量水就能在口腔內(nèi)迅速崩解吸收，因而具有起效快、可以避免首關(guān)效應(yīng)等很多優(yōu)點(diǎn)，最主要的是服用方便，適用于有吞咽困難和老、幼年患者[5]。從本試驗(yàn)結(jié)果看，試驗(yàn)用鹽酸非索非那定口腔崩解片在口腔內(nèi)崩解時(shí)間短，僅（51.8±6.5）s，口感微甜。tmax差異雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但鹽酸非索非那定口腔崩解片的tmax比普通片小，表明鹽酸非索非那定口腔崩解片具有吸收快的優(yōu)勢。鹽酸非索非那定口腔崩解片相對普通片的生物利用度為（112±36）%，可能與鹽酸非索非那定口腔崩解片相對普通片具有無肝臟首關(guān)效應(yīng)的優(yōu)勢有關(guān)，但這仍有待進(jìn)一步試驗(yàn)確定。

本試驗(yàn)健康成人口服60 mg受試制劑或參比制劑后，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)[4，6]報(bào)道接近。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，鹽酸非索非那定口腔崩解片與普通片具有生物等效性。

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