謝文利，朱 江，萬宗明，趙艷威（武警醫(yī)學院藥理學教研室，天津市 300162）

糙蘇素的抗腫瘤作用及機制研究Δ

謝文利＊，朱 江，萬宗明，趙艷威（武警醫(yī)學院藥理學教研室，天津市 300162）

目的：研究糙蘇素的抗腫瘤作用及其對端粒酶活性和細胞周期的影響。方法：采用血清藥理學與體內(nèi)、外抑瘤實驗相結合的方法，MTT法檢測糙蘇素含藥血清對體外培養(yǎng)的人白血病K562細胞增殖的抑制作用，聚合酶鏈反應-酶聯(lián)免疫吸附法檢測K562細胞在糙蘇素作用后端粒酶活性的變化，流式細胞儀分析細胞周期的改變；體內(nèi)實驗采用小鼠肝癌H22細胞株接種小鼠，連續(xù)給藥14 d，計算抑瘤率。結果：糙蘇素含藥血清在10%～50%劑量范圍內(nèi)對K562細胞有抑制作用，且呈劑量依賴關系（P＜0.05）；糙蘇素作用后端粒酶活性出現(xiàn)抑制，且各給藥組隨糙蘇素濃度增加抑制作用顯著增強（P＜0.01），同一濃度隨作用時間延長，抑制作用逐漸增強（P＜0.05）；K562細胞的DNA合成后期/分裂期（G2/M）細胞含量顯著增高（P＜0.01）；糙蘇素（2.5、5、10 mg·kg-1）灌胃能顯著抑制小鼠移植性肝癌H22細胞的生長。結論：糙蘇素具有抗腫瘤作用，其作用是通過抑制腫瘤細胞的端粒酶活性而實現(xiàn)的。

糙蘇素；端粒酶；腫瘤細胞

糙蘇素（phlomio1）為唇形科（Labiete）糙蘇屬（Phlomis）植物螃蟹甲中的一種環(huán)烯醚萜苯類成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，植物中許多環(huán)烯醚萜苷類化合物有抗炎、抗腫瘤、抗氧化和抗菌等活性[1]，因此我們推測糙蘇素可能具有抗腫瘤作用。端粒酶的激活可以維持端粒的長度并使細胞獲得無限增殖能力而逃避死亡。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)絕大部分腫瘤都呈端粒酶陽性，提示端粒酶在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。本文對糙蘇素的抗腫瘤作用及對端粒酶和細胞周期的影響進行探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DG3022A型酶標儀（瑞士Tecan公司）；ProfileⅡ型流式細胞儀（美國Coulter公司）；LDZ4型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）；TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 試藥

糙蘇素（中國藥品生物制品檢定所，批號：100641-200401）；端粒酶-PCR-ELISA檢測試劑盒（美國Boehringer Mannheim公司，批號：20071105）；MTT（美國Sigma公司，批號：071055）。

1.3 動物、細胞株及動物瘤株

健康ICR小鼠40只，♂♀兼半，體質量（21±4.6）g，北京維通利華實驗動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2002-0003）。人白血病細胞K562細胞株，由中國醫(yī)學科學院藥物研究所提供。動物移植性腫瘤小鼠H22細胞，由天津醫(yī)藥科學研究所提供。

2 方法

2.1 實驗血清制備

按文獻方法[2]制備2組實驗血清，即無藥血清和含藥血清組。每組取大鼠6只，♂♀兼半。實驗前禁食不禁水18 h，含藥血清組ig糙蘇素溶液，劑量為100 mg·kg-1；無藥血清組ig等容積生理鹽水，每天2次，連續(xù)3 d。末次給藥2 h后乙醚麻醉，眼眶靜脈無菌采血。收集的全血以2 500 r·min-1離心15 min，取血清，合并同組血清后，經(jīng)56℃水浴、30 min滅活，放入－20℃冰箱中貯藏，備用。

2.2 糙蘇素含藥血清對體外培養(yǎng)的K562細胞的抑制作用

方法[3]進行細胞復蘇、傳代，消化并計數(shù)，細胞數(shù)為1×104個·mL-1。接種于96孔板上，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細胞分為空白對照（50%）和糙蘇素含藥血清高、中、低濃度（50%、20%、10%）組。每孔加入100 μL相應濃度藥物或空白培養(yǎng)基，做4復孔。相同條件繼續(xù)培養(yǎng)48 h。終止培養(yǎng)前4 h加入20 mL MTT，培養(yǎng)結束后，離心去除上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜，振蕩器混勻，在酶標儀上于490 nm波長處測定溶液吸光度（OD）值。

2.3 糙蘇素對小鼠H22肝癌的生長抑制作用

采用常規(guī)方法[4]，分別設對照（ig，等量生理鹽水）、環(huán)磷酰胺（ip，100 mg·kg-1）和糙蘇素高、中、低劑量（ig，10、5、2.5 mg·kg-1）組。各組于接種次日開始每天給藥1次，連續(xù)給藥10 d。

2.4 端粒酶活性測定

分組同“2.2”項下方法操作。K562細胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶中至對數(shù)生長期，分別加入濃度為10%、20%、50%的糙蘇素含藥血清作用48、72 h，空白對照組加等量培養(yǎng)液。分別收集不同濃度糙蘇素作用后不同時間點的細胞（105個），加入500μL磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，4℃下3 000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀加適量細胞裂解液懸浮，置冰浴30 min，4℃下14 000 r·min-1離心20 min，吸取上清于－70℃貯藏，備用。采用Kim NW等[5]的改良聚合酶鏈反應-酶聯(lián)免疫吸附法進行測定，操作步驟均按試劑盒說明書進行。

2.5 細胞周期分析

參考文獻方法[6]分別收集10%、20%、50%的糙蘇素含藥血清作用72 h和未處理的K562細胞，用PBS清洗2次，再用預冷無水乙醇700 mL·L-1固定，4℃貯藏。檢測前離心去除乙醇，碘化丙啶染色20 min，于流式細胞儀測定細胞周期中不同時相的細胞數(shù)。

2.6 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進行分析，2組間比較采用t檢驗，多組間比較行方差分析和q檢驗。

3 結果

3.1 糙蘇素含藥血清對體外培養(yǎng)的K562細胞的抑制作用

糙蘇素對K562細胞均具有抑制作用，且在濃度為10%～50%范圍內(nèi)抑制作用呈劑量依賴性（P＜0.01或P＜0.05）。糙蘇素含藥血清對K562細胞的抑制作用見表1。

表1 糙蘇素含藥血清對K562細胞的抑制作用（±s，n＝4）Tab 1 Inhibitory effect of serum containing phlomiol on the growth of K562 tumor cell（±s，n＝4）

表1 糙蘇素含藥血清對K562細胞的抑制作用（±s，n＝4）Tab 1 Inhibitory effect of serum containing phlomiol on the growth of K562 tumor cell（±s，n＝4）

與空白對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白對照組糙蘇素含藥血清低濃度組糙蘇素含藥血清中濃度組糙蘇素含藥血清高濃度組環(huán)磷酰胺組OD值0.83±0.11 0.62±0.17＊0.43±0.12＊＊0.25±0.03＊＊0.21±0.03＊＊

3.2 糙蘇素對小鼠H22肝癌的生長抑制作用

實驗過程中可觀察到糙蘇素高、中、低劑量和環(huán)磷酰胺組小鼠飲食飲水正常、皮毛柔順光滑、活動自如，生活質量明顯優(yōu)于對照組小鼠。各組間小鼠體質量增加無顯著差異（P＞0.05）。同時，高、中、低劑量糙蘇素對腫瘤具有抑制作用（P＜0.01或P＜0.05），抑制強度呈劑量依賴性。糙蘇素對小鼠H22肝癌的生長抑制作用見表2。

3.3 糙蘇素含藥血清對端粒酶活性的影響

10%的糙蘇素含藥血清作用48 h后端粒酶活性出現(xiàn)抑制，且各給藥組隨糙蘇素濃度增加抑制作用顯著增強（P＜0.01）；同一濃度隨作用時間延長，抑制作用逐漸增強（P＜0.05）。糙蘇素含藥血清對端粒酶活性的影響見表3。

3.4 糙蘇素含藥血清對細胞周期的影響

采用10%、20%、50%的糙蘇素含藥血清作用72h后的K562細胞的G2/M期細胞數(shù)所占百分比均明顯提高（P＜0.01或P＜0.05），20%糙蘇素含藥血清組與50%糙蘇素含藥血清組比較無顯著差異（P＞0.05）。糙蘇素含藥血清對細胞周期的影響見表4。

表2 糙蘇素對小鼠H22肝癌的生長抑制作用（±s，n＝8）Tab 2 Inhibitory effect of phlomiol on the growth of mice hepatic cancer H22 cell（±s，n＝8）

表2 糙蘇素對小鼠H22肝癌的生長抑制作用（±s，n＝8）Tab 2 Inhibitory effect of phlomiol on the growth of mice hepatic cancer H22 cell（±s，n＝8）

與空白對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

抑制率/%組別空白對照組糙蘇素低劑量組糙蘇素中劑量組糙蘇素高劑量組環(huán)磷酰胺組體質量增加/g 4.6±1.5 4.8±1.2 4.0±1.4 4.3±1.8 3.1±0.6瘤重/g 1.77±0.35 1.15±0.23＊0.83±.015＊＊0.45±0.12＊＊0.28±0.05＊＊35.0 53.1 74.5 84.1

表3 糙蘇素含藥血清對端粒酶活性的影響（±s，n＝4）Tab 3 Effect of serum containing phlomiol on the activity of telomeras（e±s，n＝4）

表3 糙蘇素含藥血清對端粒酶活性的影響（±s，n＝4）Tab 3 Effect of serum containing phlomiol on the activity of telomeras（e±s，n＝4）

與空白對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白對照組糙蘇素含藥血清低濃度組糙蘇素含藥血清中濃度組糙蘇素含藥血清高濃度組環(huán)磷酰胺組OD值48 h 1.70±0.09 0.71±0.11＊0.57±0.05＊＊0.32±0.06＊＊0.17±0.03＊＊72 h 1.51±0.02 0.66 ±0.03＊＊0.47±0.02＊＊0.27±0.03＊＊0.25±0.03＊＊

表4 糙蘇素含藥血清對細胞周期的影響（±s，n＝4）Tab 4 Effect of serum containing phlomiol on cell cycle（±s，n＝4）

表4 糙蘇素含藥血清對細胞周期的影響（±s，n＝4）Tab 4 Effect of serum containing phlomiol on cell cycle（±s，n＝4）

與空白對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別空白對照組糙蘇素含藥血清低濃度組糙蘇素含藥血清中濃度組糙蘇素含藥血清高濃度組環(huán)磷酰胺組K562細胞的G2/M期細胞數(shù)所占百分比/%19.1±1.5 43.3±4.5＊62.5±6.4＊＊58.1±4.2＊＊60.9±3.2＊＊

4 討論

糙蘇屬植物在全球約有100種以上，在我國，糙蘇屬植物多作藥用，中醫(yī)學、民族醫(yī)學的藥性理論認為本屬植物具有理氣健脾、清熱解毒、消腫止痛、祛風活絡、活血調經(jīng)、止咳化痰之功效，廣泛用于治療消化不良、筋骨疼痛、瘡疥腫毒、咳嗽痰多、感冒發(fā)熱、風濕性關節(jié)炎、肺炎、支氣管炎等疾病[7]。糙蘇素為糙蘇屬植物螃蟹甲中的一種環(huán)烯醚萜類成分，該成分很可能就是糙蘇屬植物治療“瘡疥腫毒”的主要藥理基礎，即抗腫瘤作用的主要成分[8]。

筆者采用體內(nèi)、體外2種方法對糙蘇素的抗腫瘤作用及其機制進行了初步研究，其中體外實驗采用了血清藥理學的方法，它排除了傳統(tǒng)中藥體外實驗中中藥本身的理化性質對實驗的干擾，又能反映藥物在體內(nèi)的生物轉化過程及其作用結果[9]。近年來，中藥抗腫瘤分子機制的研究主要集中在誘導凋亡、誘導分化、端粒酶抑制、微管蛋白活性抑制等方面，筆者選擇的是端粒酶活性測定及細胞周期分析的方法。端粒酶特異性地表達于各種腫瘤細胞，又是腫瘤細胞無限增殖能力所必需，那么，理論上端粒酶的抑制可能導致腫瘤細胞生長停止或死亡[10]。

研究結果表明，糙蘇素含藥血清體外可以抑制細胞生長，具有抑制K562細胞端粒酶活性的作用，而且該作用具有時間和劑量依賴性；采用流式細胞儀進行細胞周期分析表明，端粒酶活性被抑制72 h后，K562細胞增殖也出現(xiàn)障礙，將49.3%以上的K562細胞阻滯在G2/M期，結果表明，端粒酶活性依賴于細胞所處的分裂周期的時相。體內(nèi)實驗中，荷瘤小鼠ig糙蘇素可以使H22腫瘤顯著抑制?？傊?，糙蘇素體內(nèi)、外均有抗腫瘤作用，糙蘇素對腫瘤細胞的抑制和細胞周期阻滯作用可能與端粒酶抑制有關。

參考文獻

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Anti-tumor Effect of Phlomiol and Its Mechanism Study

XIE Wen-li，ZHU Jiang，WAN Zong-ming，ZHAO Yan-wei（Dept.of Pharmacology，Medical College of Chinese Armed Police Force，Tianjin 300162，China）

OBJECTIVE：To study the anti-tumor effect of phlomiol，and its influences on the activity of telomerase and cells phases.METHODS：Serologic pharmacological method，in vivo and in vitro anti-tumor experiments were adopted in the study.The inhibition effect of serum containing phlomiol on the proliferation of K562 tumor cells in vitro were detected by MTT method.The activity of telomerase in K562 tumor cell was determined by TRAP-PCR-ELISA.Flow cytometry was used to analyze the change of cell cycle.In vivo experiment，mice was inoculated with hepatic cancer H22 cells and the mice were orally administrated with phlomiol for 14 days.The inhibition rate of tumor was caculated.RESULTS：Serum containing 10%～50%phlomiol inhibited the proliferation of K562 tumor cells in vitro in dose-dependent manner（P＜0.05）.Phlomiol inhibited the activity of telomerase in K562 tumor cells.The inhibition effect was in dose-dependent manner（P＜0.01）.Meanwhile the inhibition effect increased gradually when the action time extended in the same dose of phlomiol group（P＜0.05）.The content of cell in K562 tumor cells were markedly increased in G2/M phase（P＜0.01）.Phlomiol（2.5，5，10 mg·kg-1，i.g）inhibited the growth of implanted hepatic cancer H22 cells signiflcantly.CONCLUSION：The anti-tumor activity of phlomiol is performed by inhibiting the activity of telomerase in tumor cells.

Phlomiol；Telomerase；Tumor cells

R285；R94

A

1001-0408（2010）39-3653-03

2009-12-07

2010-04-18）