劉衛(wèi)斌，薛彥寧，秦永剛（.陜西榆林市第二醫(yī)院，榆林市 79000；.陜西中藥研究所，咸陽(yáng)市 7000）

魚(yú)精蛋白凝聚法測(cè)定和厚樸酚脂質(zhì)體的包封率

劉衛(wèi)斌1＊，薛彥寧1，秦永剛2（1.陜西榆林市第二醫(yī)院，榆林市 719000；2.陜西中藥研究所，咸陽(yáng)市 712000）

目的：建立和厚樸酚脂質(zhì)體包封率（EE）的測(cè)定方法。方法：以反相高效液相色譜法為分析手段，采用魚(yú)精蛋白凝聚法測(cè)定和厚樸酚脂質(zhì)體EE。結(jié)果：和厚樸酚檢測(cè)濃度在2.006～160.512 mg·L-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r＝0.999 9），最低檢測(cè)限和最低定量限分別為1.4、4.0 ng；魚(yú)精蛋白凝聚法的平均回收率為（95.70±2.07）%，RSD＝1.71%（n＝9）；平均EE為85.87%。結(jié)論：魚(yú)精蛋白凝聚法操作簡(jiǎn)單、可行、重現(xiàn)性好，適用于脂溶性藥物和厚樸酚脂質(zhì)體EE的測(cè)定。

和厚樸酚脂質(zhì)體；反相高效液相色譜法；包封率；魚(yú)精蛋白凝聚法

和厚樸酚為木蘭科落葉喬木植物厚樸Magnolia officinalisCortex的有效成分，是從厚樸中分離得到的具有生物活性的小分子物質(zhì)。藥理學(xué)研究證明，和厚樸酚具有抗氧化[1]、抗焦慮[2]、抗菌[3]、抗血栓形成[4]和抗腫瘤[5～7]的作用。和厚樸酚水溶性差，幾乎不溶于注射用水，故影響了其在臨床中的應(yīng)用。將和厚樸酚開(kāi)發(fā)成脂質(zhì)體劑型，可以解決其難溶問(wèn)題，提高藥物穩(wěn)定性、載藥量、靶向性及療效。脂質(zhì)體還可能延長(zhǎng)和厚樸酚在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，改善其在體內(nèi)的吸收及分布。脂質(zhì)體制備過(guò)程中，包封率（EE）是控制質(zhì)量與篩選處方和工藝條件的重要指標(biāo)之一。2005年版《中國(guó)藥典》（二部）規(guī)定，脂質(zhì)體EE不得低于80%[8]，所以建立快速、準(zhǔn)確的EE測(cè)定方法是研制脂質(zhì)體重要的環(huán)節(jié)。本研究將以高效液相色譜（HPLC）法為分析手段，采用魚(yú)精蛋白凝聚法測(cè)定建立一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可操作性強(qiáng)的測(cè)定和厚樸酚脂質(zhì)體EE的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC2010型HPLC系統(tǒng)（日本島津公司）；AL104型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥

和厚樸酚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110730-200408，純度≥99.0%）；和厚樸酚原料藥（西安融升生物科技有限公司，純度≥98.0%）；磷脂（成都科龍化工試劑廠(chǎng)，純度≥98.0%）；膽固醇（成都科龍化工試劑廠(chǎng)，純度≥98.0%）；聚乙二醇（PEG，成都科龍化工試劑廠(chǎng)，分子量：2 000）；魚(yú)精蛋白（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：YY15284）；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenex C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（65∶35）；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：294 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按和厚樸酚色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白脂質(zhì)體；B.和厚樸酚脂質(zhì)體；C.和厚樸酚對(duì)照品Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank liposomes；B.honokiol liposomes；C.honokiol control

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取和厚樸酚對(duì)照品50.16 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成含和厚樸酚濃度為1.003 2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，冰箱4℃貯存，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取一定體積的和厚樸酚對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相稀釋成2.006 4、5.016、10.032、20.064、40.128、80.256、160.512 mg·L-1的溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣。以峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，和厚樸酚檢測(cè)濃度（C，mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程為A＝16 400C－2 763（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，和厚樸酚的檢測(cè)濃度在2.006～160.512 mg·L-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取5.016、20.064、80.256 mg·L-1的和厚樸酚對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件于日內(nèi)（0、2、4、6、8、10 h）各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算日內(nèi)精密度。結(jié)果，3個(gè)濃度的RSD分別為0.29%、0.21%、0.15%（n均為6），表明日內(nèi)精密度良好。取相同濃度的和厚樸酚對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件于日間（1、2、3、4、5 d）進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算日間精密度。結(jié)果，3個(gè)濃度的RSD分別為1.92%、0.74%、1.59%（n均為6），表明日間精密度良好。

2.3.3 加樣回收率試驗(yàn) 取空白脂質(zhì)體溶液0.05 mL，置于2 mL EP離心管中，再分別加入7.5、30.0、120.0 μL濃度為1.003 2 mg·mL-1的和厚樸酚對(duì)照品溶液，加乙腈分別至1.5 mL，使和厚樸酚檢測(cè)濃度分別為5.016、20.064、80.256 mg·L-1，超聲1 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度平行操作3份，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.3.4 最低檢測(cè)限和最低定量限測(cè)定 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，將2.0、1.0、0.5、0.1 mg·L-1的和厚樸酚對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。采用基線(xiàn)信號(hào)與噪聲比方法，以信號(hào)∶噪聲＝3∶1時(shí)的濃度為最低檢測(cè)限濃度；照《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》[8]，以信號(hào)∶噪聲＝10∶1時(shí)的濃度為最低定量限濃度。即最低檢測(cè)限和最低定量限分別為1.4、4.0 ng。

2.4 和厚樸酚脂質(zhì)體的制備

采用薄膜超聲法，精密稱(chēng)取磷脂-膽固醇-PEG（1∶0.3∶0.08，W/W）/W為總脂，將和厚樸酚-總脂（1∶4）加入到一定量裝有甲醇的圓底燒瓶中溶解，減壓蒸發(fā)成薄膜，加入一定量水進(jìn)行水化處理，超聲處理，即得和厚樸酚脂質(zhì)體。

2.5 粒徑和電位測(cè)定

取和厚樸酚脂質(zhì)體溶液，用超純水稀釋?zhuān)瑴y(cè)定其粒徑大小和Zeta電位。結(jié)果，平均粒徑為93.84 nm，平均電位為－21.8 mV。

2.6 魚(yú)精蛋白凝聚法

采用魚(yú)精蛋白凝聚法分離游離藥物與脂質(zhì)體。用移液槍精密吸取0.1 mL和厚樸酚脂質(zhì)體于2 mL EP管中，加入10 mg·mL-1的魚(yú)精蛋白溶液0.1 mL，渦旋60 s，靜置3 min，加入1 mL生理鹽水，混勻，室溫下以3 000 r·min-1離心30 min，沉淀脂質(zhì)體。精密吸取上清液0.1 mL，以流動(dòng)相稀釋后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并計(jì)算游離藥物含量（C游）。

2.7 魚(yú)精蛋白凝聚法加樣回收率試驗(yàn)

配制低、中、高濃度（0.106 1、0.285 6、0.641 5 mg·L-1）的游離和厚樸酚乙醇-水溶液，加入空白脂質(zhì)體（粒徑約為100 nm），得混合脂質(zhì)體混懸液。取上述脂質(zhì)體混懸液0.1 mL，添加0.1 mL 魚(yú)精蛋白（10 mg·mL-1），攪勻，靜置3 min，加入1.0 mL生理鹽水，3 000 r·min-1離心30 min，沉淀脂質(zhì)體。精密吸取上清液0.1 mL，以流動(dòng)相稀釋后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 魚(yú)精蛋白凝聚法加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test of protamine aggregation method（n＝9）

2.8 和厚樸酚脂質(zhì)體EE測(cè)定

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定“2.4”項(xiàng)下制得的和厚樸酚脂質(zhì)體中和厚樸酚含量（C總），并根據(jù)下式計(jì)算和厚樸酚脂質(zhì)體EE：EE＝（C總－C游）/C總×100%。結(jié)果，和厚樸酚在脂質(zhì)體中的EE可達(dá)到80%以上，平均值為85.87%，詳見(jiàn)表2。

表3 和厚樸酚脂質(zhì)體EE測(cè)定結(jié)果Tab 3 Encapsulation efficiency of honokiol liposomes

3 討論

為準(zhǔn)確測(cè)定脂質(zhì)體EE，將脂質(zhì)體和游離藥物分離是關(guān)鍵步驟。本試驗(yàn)曾采用SephadexG-50凝膠柱層析法分離脂質(zhì)體與游離和厚樸酚，因?yàn)楹秃駱惴硬蝗苡谒?，?dāng)用pH 7.4的PBS進(jìn)行洗脫時(shí)，游離和厚樸酚截留在凝膠柱頂端，待脂質(zhì)體完全洗出柱子后，截留在柱子頂端的游離和厚樸酚緩慢被洗出凝膠柱，色譜峰很寬且不規(guī)則，洗脫時(shí)間很長(zhǎng)，測(cè)定不準(zhǔn)確。本試驗(yàn)也曾采用透析法，此法雖操作簡(jiǎn)單，但耗時(shí)較長(zhǎng)，且重復(fù)性不好，故該方法有待考察。超速離心法對(duì)離心機(jī)轉(zhuǎn)速要求較高，儀器耗費(fèi)較大，離心時(shí)間通常需要1 h以上，方法成本較高。和厚樸酚水溶性差，而凝膠柱分離法、透析法、超濾法等都是用于分離水溶性藥物。為了探討一種簡(jiǎn)單、速效、準(zhǔn)確的脂質(zhì)體EE的測(cè)定方法，本試驗(yàn)建立了魚(yú)精蛋白絮凝-離心法分離脂質(zhì)體，以RP-HPLC法為分析手段，測(cè)定脂質(zhì)體藥物EE。

魚(yú)精蛋白的最大特點(diǎn)就是堿性氨基酸占有較大比例[9]，其等電點(diǎn)為10～12，可溶于水和稀酸，熱穩(wěn)定性較好。本文所用魚(yú)精蛋白是鮭魚(yú)精蛋白（salmine），約含2/3以上的精氨酸。精氨酸是一種含有胍基的堿性氨基酸，帶正電，正是由于這些帶有正電荷的胍基的大量存在，多聚陽(yáng)離子魚(yú)精蛋白會(huì)與帶負(fù)電或中性的脂質(zhì)體產(chǎn)生絮凝作用，常規(guī)離心即可將脂質(zhì)體和游離藥物分離。因此，它是一種針對(duì)脂質(zhì)體電荷性質(zhì)的凝聚離心法，具有快速、可操作性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。魚(yú)精蛋白凝聚法的適用范圍比較廣泛，可以測(cè)定不同溶解性質(zhì)藥物脂質(zhì)體的EE，但此法也存在一定的局限性：脂質(zhì)體的Zeta電位對(duì)魚(yú)精蛋白凝聚法測(cè)定脂質(zhì)體EE有一定影響，它更適于中性或負(fù)電荷脂質(zhì)體的分離。

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Determination of Encapsulation Efficiency of Honokiol Lipsomes by Protamine Aggregation Method

LIU Wei-bin，XUE Yan-ning（Yulin Municipal Second Hospital of Shaanxi Province，Yulin 719000，China）
QIN Yong-gang（Shaanxi Institute of Chinese Materia Medica，Xianyang 712000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of encapsulation efficiency（EE）of honokiol liposomes.METHODS：RP-HPLC method was adopted for the analysis of honokiol liposomes.Protamine aggregation method was applied to determinate the encapsulation efficiency of honokiol liposomes.RESULTS：The linear range of honokiol was 2.006～160.512 mg·L-1.The limits of detection and quantitation were 1.4 ng and 4.0 ng，respectively.The mean recovery rate of protamine aggregation method was（95.70±2.07）%（RSD＝1.71%，n＝9）.The mean encapsulation efficiency of honokiol liposomes was 85.87%.CONCLUSION：The protamine aggregation method is simple，practical and reproducible for determination of the encapsulation efficiency of honokiol liposomes.

Honokiol liposomes；RP-HPLC；Encapsulation efficiency；Protamine aggregation method

R283.2；283.69

A

1001-0408（2010）39-3695-03

＊主任藥師。研究方向：中藥學(xué)。電話(huà)：0912-3362085。E-mail：leibaolin@163.com

2010-06-16

2010-08-27）