陳彩云 丁寅 劉亞京 張雅博

（第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院 正畸科，陜西 西安 710032）

滑膜炎癥是顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病（temporomandibular disorder，TMD）中的重要類型之一，也是一些頑固性疼痛的原因之一，受到愈來愈多的關(guān)注。咬合距離的改變將導(dǎo)致髁突位置的改變，引起咀嚼肌和顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TMJ）一系列適應(yīng)性和病理性的改變，咀嚼力降低導(dǎo)致髁突形成減少和下頜升支高度降低，是錯患者垂直向不調(diào)的主要原因。有證據(jù)表明伴有垂直向不調(diào)的錯患者更容易患TMD。目前對TMJ的研究主要集中于髁突軟骨，對滑膜的研究很少。臨床上垂直向不調(diào)的正畸矯治非常困難，并且在矯治過程中常常出現(xiàn)TMJ的癥狀，本研究通過模擬這類患者的錯，建立TMJ滑膜炎的動物模型，以此為載體探討咀嚼肌活動和咬合的改變在關(guān)節(jié)病形成中的作用，為正畸臨床預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

選取由第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心提供的6周齡雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量為150～170 g，無明顯全身疾患和口頜系統(tǒng)功能障礙。將實驗動物隨機分為4組，分別為對照組、升高咬合組、切除咬肌組、切除咬肌加升高咬合組，每組4只。

1.2 建立咀嚼力降低和升高咬合的動物模型

1.2.1 切除咬肌 將切除咬肌加升高咬合組、切除咬肌組SD大鼠的咬肌從咬肌附麗的起止點即從上頜骨顴突和顴弓下緣的前2/3到咬肌粗隆和下頜支外側(cè)面的下半部完全切除，不應(yīng)有殘留，注意手術(shù)中勿傷及重要的血管神經(jīng)，縫合時盡量減小死腔的大小，術(shù)后每天給予每只大鼠腹腔注射青霉素80萬單位，注射3 d，防止感染。術(shù)后常規(guī)飲食。實驗期為3周。

1.2.2 升高咬合 在切除咬肌加升高咬合組、升高咬合組共8只9周齡SD大鼠的雙側(cè)上頜第一和第二磨牙上直接粘接后牙用耐磨光固化樹脂來制作墊，墊長7.0 mm、寬2.0 mm、高2.0 mm。實驗期為1周。

1.3 標(biāo)本的處理

于實驗后第4周，大鼠10周齡時，在40 mg·kg-1戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉下，經(jīng)心臟主動脈插管灌注0.9%的NaCl溶液（每只100 mL）和40 g·L-1多聚甲醛溶液（pH=7.4）（每只400 mL），取出雙側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)，40 g·L-1多聚甲醛溶液固定24 h，置于150 g·L-1乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）中脫鈣1周，常規(guī)脫水，石蠟包埋，經(jīng)髁突矢狀面低溫連續(xù)切片，厚度為5 μm。

1.4 組織形態(tài)學(xué)染色及圖像分析

每個標(biāo)本取左右關(guān)節(jié)各1張切片，共計32張。常規(guī)蘇木精-伊紅染色，在Olympus VANOX AHBT3萬能顯微鏡下應(yīng)用計算機DP Controller軟件系統(tǒng)采圖，在鏡下（×200）由2名觀察者在盲法下觀察各樣本組織形態(tài)學(xué)變化并計數(shù)，通過組織病理診斷鑒定顳下頜關(guān)節(jié)滑膜炎動物模型的確立。本實驗主要觀察關(guān)節(jié)盤的前帶（anterior band，AB）下面和后帶（posterior band，PB）被覆的滑膜組織（圖1）。染色結(jié)果判斷標(biāo)準[1]如下。滑膜襯里增生分為3個等級：1）0級為1～3層著色；2）1級為4～6層著色；3）2級為不小于7層著色。血管擴張分為3個等級：1）0級為未出現(xiàn)；2）1級為累及小于1/3滑膜長度；3）2級為累及1/3～2/3滑膜長度。纖維素沉積的等級劃分標(biāo)準同血管擴張。

圖 1 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)矢狀面切片示意圖Fig 1 A schematic diagram of a sagittal section of the rat TMJ

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計軟件SAS 9.1對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，對等級資料采用Kruskal-Wallis H檢驗以及Nemenyi檢驗進行分析，所有樣本均采用雙側(cè)檢驗，檢驗水準為0.05。

2 結(jié)果

2.1 體重變化

實驗結(jié)束時，4組動物隨著鼠齡的增加，體重逐漸增加，各組間體重變化無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

圖 2 4組大鼠的體重變化Fig 2 The change of rats′weight in the four groups

2.2 滑膜組織學(xué)變化

對照組TMJ關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層光滑，固有層細胞不超過4層，滑膜下層中血管形態(tài)正常，組織排列規(guī)則，說明滑膜沒有出現(xiàn)炎癥性改變。在升高咬合組和切除咬肌組，固有層細胞層數(shù)增加，滑膜下層的血管形態(tài)不規(guī)則，管腔變大，發(fā)生血管擴張，但二者間固有層細胞增生和血管擴張間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與升高咬合組和切除咬肌組相比，切除咬肌加升高咬合組滑膜有明顯的炎癥（P＜0.05），包括固有層細胞明顯增生，滑膜下層血管明顯擴張，管腔內(nèi)出現(xiàn)明顯紅染的無定形物質(zhì)即纖維素沉積（圖3）。組織學(xué)染色結(jié)果計數(shù)見表1。

圖 3 組織形態(tài)學(xué)的變化 HE ×200Fig 3 Histomorphology changes HE ×200

表 1 各組樣本滑膜組織形態(tài)學(xué)變化結(jié)果Tab 1 The morphological changes of synovial tissue of each group

3 討論

本研究采用切除大鼠雙側(cè)咬肌和升高咬合垂直距離來誘導(dǎo)大鼠TMJ滑膜的炎癥損害，在切除咬肌加升高咬合組觀察到明顯的滑膜炎癥表現(xiàn)，說明了該方法所致病變的一致性以及良好的可重復(fù)性。

有學(xué)者[2]測量Wistar大鼠的息止頜間隙是1 mm。咬合升高2 mm是其最大張口時磨牙區(qū)間隙的30%，認為咬合升高2 mm屬于生理范圍[3]。故本實驗將大鼠的咬合升高了2 mm。由于構(gòu)成咀嚼肌的肌肉超過50%為咬肌，并且咬合力的大小與咬肌厚度直接相關(guān)[4]，因此本研究選擇切除咬肌來削弱咀嚼力。咬肌切除后顳肌和翼外肌產(chǎn)生代償參與咀嚼運動[1]，另外瘢痕的形成也是一種補償[5]，使得各組動物的體重變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

TMJ滑膜組織可分為固有層和滑膜下層。固有層為細胞內(nèi)膜，通常由1～4層滑膜細胞構(gòu)成，其下方并無基底膜樣結(jié)構(gòu)，細胞間為無定形間質(zhì)，不含纖維?；は聦訛槭杷山Y(jié)締組織，含有血管和神經(jīng)以及成纖維細胞、巨噬細胞、肥大細胞、脂肪細胞等細胞成分?；す逃袑优c滑膜下層無明顯界限[6]。

在升高咬合組觀察到血管擴張。由于滑膜組織對垂直距離的改變較敏感，尤其是滑膜皺襞處，該處是分泌滑液的主要部位。張紅梅等[7]研究發(fā)現(xiàn)升高大鼠的咬合后，在實驗第7天觀察到TMJ有退行性改變，這與本研究觀察到的結(jié)果一致。然而由于作用時間短，刺激小，滑膜組織只是發(fā)生了輕微的急性炎癥反應(yīng)。發(fā)生急性炎癥時組織的改變主要是以血管反應(yīng)為中心的滲出性變化，血管的變化最早也最明顯。而纖維素是由纖維蛋白滲出到血管外，在壞死物質(zhì)釋放的組織因子作用下轉(zhuǎn)化而來，只有在毛細血管和小靜脈損傷較重，血管通透性明顯升高時才能出現(xiàn)纖維素滲出沉積在管腔內(nèi)，因此，在升高咬合組可觀察到血管擴張，而纖維素滲出很少。

在切除咬肌組固有層細胞發(fā)生增殖，這可能是手術(shù)本身造成的慢性炎癥反應(yīng)，滑膜組織發(fā)生適應(yīng)性的改建，隨著時間的推移，組織的炎癥反應(yīng)將逐漸消退，但這需要進一步的研究來證實。Yonemitsu等[8]觀察了切除發(fā)育期大鼠咬肌的動物成年后下頜的發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)切除咬肌的大鼠成年后髁突長度和下頜升支高度降低，進一步研究還發(fā)現(xiàn)咬肌切除后成軟骨細胞帶厚度變薄，尤其是增殖帶，其發(fā)生機制可能是咬肌切除后咬合力量降低，對髁突表面的壓力載荷減少，引起成軟骨細胞的增殖和分化減少。這說明過小的咬合力對TMJ和下頜的發(fā)育不利，然而Lucchinetti等[9]研究發(fā)現(xiàn)咬合力量過大也會導(dǎo)致關(guān)節(jié)的退行性改變。本實驗中觀察到固有層細胞有少量增生，而血管擴張和纖維素滲出并不明顯，因此認為咀嚼力降低對髁突軟骨的影響較大，而對TMJ滑膜的炎癥損害不明顯，這與Tanne[10]的觀點一致。

在切除咬肌加升高咬合組可以觀察到明顯的炎癥反應(yīng)，固有層細胞增生、滑膜下組織的血管擴張和纖維素沉積，這與Ozaki等[1]觀察到的結(jié)果一致。垂直距離的不調(diào)對TMJ滑膜、翼外肌上頭和咬肌的影響最為顯著[11]，其中又以盤前伸部翼外肌上頭附麗部和盤外側(cè)咬肌附麗部尤為顯著。垂直向不調(diào)往往使咀嚼肌張力增高，其張力必然要傳導(dǎo)到肌肉附麗部，如翼外肌上頭髁側(cè)端、部分附麗于軟的關(guān)節(jié)盤前伸部、部分附麗于硬的髁突頸部，這就使得收縮時的張力變化出現(xiàn)差異，肌肉的穩(wěn)定性降低，可見垂直向不調(diào)打破了咀嚼肌系統(tǒng)和TMJ平衡。切除咬肌后，進一步加劇了咀嚼肌和TMJ內(nèi)部的不平衡，這種不平衡超過了機體的適應(yīng)能力，發(fā)生了一系列生理、生化、免疫以及炎癥反應(yīng)[12]?；ぜ毎梢苑置诙喾N細胞因子，如白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，這些細胞因子對關(guān)節(jié)的破壞、各種癥狀的產(chǎn)生有密切的關(guān)系[6]?；そM織在各種細胞因子的復(fù)雜作用下發(fā)生滑膜細胞增生、血管擴張、纖維素滲出沉積等炎癥性關(guān)節(jié)炎的特征性改變之一。

大鼠TMJ滑膜炎癥模型具有可重復(fù)性、短期內(nèi)發(fā)生以及良好的相似性三大要素，符合動物模型的基本要求。此外SD大鼠性情較溫順，價格便宜，易于飼養(yǎng)，耐受力強，其咬肌運動與人類相似[13]，且位置表淺，手術(shù)容易，并且相同周齡的大鼠磨牙大小基本相同，口內(nèi)樹脂墊大小一致，故不失為研究伴有垂直向不調(diào)正畸患者TMD病理改變、發(fā)病機制及治療的較為理想的實驗動物模型。

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