張慕蕊 王 巖趙東旭 李新娜 李 群 李玉林

(吉林大學白求恩醫(yī)學院病理生物學教育部重點實驗室,吉林 長春 130021)

逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的靶向人 Slingshot-1L基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立

張慕蕊 王 巖1趙東旭 李新娜 李 群 李玉林

(吉林大學白求恩醫(yī)學院病理生物學教育部重點實驗室,吉林 長春 130021)

目的 應(yīng)用 Slingshot(SSH)-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,建立過表達該基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。方法 用脂質(zhì)體法將含 SSH-1L的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-SSH-1L轉(zhuǎn)染 PA 317包裝細胞,G418篩選,滴度測定。收集病毒上清感染MG63細胞,G418篩選。結(jié)果 應(yīng)用 pLNCXSlingshot-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,獲得滴度為5×108CFU/L的病毒上清,感染MG63細胞,獲得了過表達 SSH-1L基因的MG63細胞。結(jié)論 應(yīng)用SSH-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,成功建立了過表達該基因的穩(wěn)定細胞系。

逆轉(zhuǎn)錄病毒;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

細胞骨架蛋白家族成員肌動蛋白(actin)通過解聚、重聚的動態(tài)變化,在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。肌動蛋白解聚因子(Cofilin)是絲切因子家族的一員,主要功能是增強 actin活力,參與調(diào)控細胞的移動〔1〕。Slingshot(SSH)是一種特異的 Cofilin磷酸酶,可使 Cofilin去磷酸化而活化,進而抑制 actin絲聚合,對細胞遷移至關(guān)重要〔2〕。目前國內(nèi)外對 SSH的研究才剛剛開始。本文應(yīng)用 SSH-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體獲得高滴度的病毒上清,建立過表達該基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系,為研究腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 MG63、PA 317及N IH3T3細胞為本實驗室保存。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLNCX-SSH-1L由王巖教授惠贈(SSH-1L基因全長插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLNCXMCS多克隆位點,末端含有 c-m yc tag)。脂質(zhì)體 2000購自 Invitrogen公司,高糖DM EM培養(yǎng)基購自美國 Gibco公司,胎牛血清購自 Hyc lone公司,胰蛋白酶和 EDTA購自 Sigm a公司,免疫組織化學試劑盒購自福州邁新公司。抗人 c-m yc tag抗體購自博奧森生物工程有限公司,抗人 P-cofilin抗體、抗人 Cofilin抗體購自美國 SantaCruz公司。引物 hSSH-1L前向:CACAAGCATGCAGGTGATCT,反向:TATGTGCATCCTTCCTGCTG(306 bp);GAPDH前向: GCATCCTCACCCTGAAGTAC,反向:TGGTGCCGCCAGACAGCACT(750 bp)由上海生工合成。

1.2 病毒包裝及陽性克隆篩選 將 PA 317細胞接種于 6孔板中,至細胞長滿約 80%時用脂質(zhì)體法將 pLNCX-SSH-1L重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 PA 317細胞,參考 Invitrogen公司試劑盒說明書操作。轉(zhuǎn)染 48 h后以 1∶8傳代,然后用含 800m g/L G418和 10%胎牛血清的 H-DM EM培養(yǎng)基篩選。10 d后可見陽性克隆,挑選克隆,繼續(xù)培養(yǎng),待細胞接近完全融合時移取上清,即含有病毒的培養(yǎng)液。以未轉(zhuǎn)染的 PA 317細胞作對照。

1.3 計算病毒滴度 將 N IH 3T3細胞以 1×105細胞/孔接種于 6孔板中。收集病毒液,經(jīng)醋酸纖維素膜濾器過濾后,制備 6個系列稀釋梯度的病毒液,加入 6孔板,Po lybrene終濃度為8μg/m l。病毒感染 24 h后,用含 500μg/m l G418培養(yǎng)液篩選1 w。計算公式如下:病毒滴度 =最高稀釋度形成的克隆數(shù) ×稀釋因子。

1.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立 將MG63細胞以 1×105細胞/孔接種于 6孔板中,從包裝細胞 PA 317收集的病毒液,經(jīng)醋酸纖維素膜濾器過濾后,將病毒液加至MG63細胞,間隔 24 h后可再次感染病毒,Po lybrene的終濃度為 8μg/m l。24 h后更換含 500μg/m l G418培養(yǎng)液篩選,2 w后獲得陽性克隆,隨機挑選陽性克隆擴增培養(yǎng),G418濃度降為 200μg/m l。

1.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的鑒定

1.5.1 用抗人 c-m yc tag抗體對轉(zhuǎn)染后的細胞進行免疫熒光測定 轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的MG63細胞鋪細胞爬片,待爬片上的細胞長滿 80%時用 PBS沖洗,4%多聚甲醛室溫固定 30m in,PBS沖洗,加過氧化物酶阻斷劑,血清封閉,加一抗 (抗人 c-m yc tag抗體),4℃孵育過夜,PBS沖洗,加 FITC標記的二抗,避光孵育,PI染核。胞漿中出現(xiàn)綠色熒光為陽性反應(yīng)。

1.5.2 應(yīng)用 RT-PCR檢測 SSH-1L的表達情況 提取轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染MG63細胞的總 RNA,測定純度及含量,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA (RT),PCR擴增,SSH-1L反應(yīng)條件為 94℃ 2 m in, 94℃1m in、60℃ 30 s、72℃ 30 s 33個循環(huán),72℃ 7 m in, 4℃10m in,GAPDH反應(yīng)條件為 95℃2m in、95℃30 s、55℃30 s、72℃30 s28個循環(huán),72℃10m in,4℃10m in,反應(yīng)結(jié)束后,取 PCR產(chǎn)物5μl,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,紫外燈下觀察,照相記錄結(jié)果。

1.5.3 W estern印跡檢測 Cofilin和 P-cofilin的表達情況 裂解細胞,離心取上清加入凝膠加樣緩沖液,沸水浴上加熱5m in,上樣量為 20μl,電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、ECL顯色。

2 結(jié) 果

2.1 pLNCX-SSH-1L轉(zhuǎn)染包裝細胞 PA 317 轉(zhuǎn)染后第 5天可見 PA 317細胞大批死亡,第 7天陰性對照組全部死亡,第 10天實驗組出現(xiàn)由數(shù)個細胞組成的陽性克隆(圖 1),2 w左右陽性克隆接近融合。

2.2 病毒液的產(chǎn)生及病毒滴度的測定 待陽性克隆接近融合,收集 PA 317細胞的病毒上清,感染N IH3T3細胞 24 h后,用含 500μg/m l G418培養(yǎng)液篩選 1 w,測定病毒滴度為 5×108CFU/L。

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的建立 收集病毒上清,感染M G63細胞。經(jīng) 500μg/m lG418培養(yǎng)液篩選 2 w后,獲得 18個陽性細胞克隆,隨機挑選 5個陽性克隆擴增培養(yǎng),G418濃度降至200μg/m l(圖 2)。

圖1 pLNCX-SSH-1L轉(zhuǎn)染包裝細胞PA 317,獲得陽性克隆(×100)

圖2 獲得M G63細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陽性細胞克隆

2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的鑒定 用 c-m yc tag抗體對轉(zhuǎn)染后的細胞進行免疫熒光測定,結(jié)果顯示MG63細胞感染率為 90%以上(圖3)。應(yīng)用RT-PCR檢測 SSH-1L的表達情況,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組 SSH-1L的表達明顯增強 (圖 4)。W estern印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組,P-cofilin的表達明顯減少 (圖5),證實過表達 SSH-1L的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系建立成功。

圖 3 免疫熒光檢測M G63細胞的感染率(×100)

圖4 RT-PCR檢測SSH-1L的表達情況

圖5 W estern印跡檢測結(jié)果

3 討 論

癌細胞可侵入鄰近組織和血管,最終導致轉(zhuǎn)移。細胞的移動始與膜突觸的形成,而膜突觸形成的驅(qū)動力取決于膜上肌動蛋白絲的聚合,還需要一些與之結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白參與〔3〕。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種 actin結(jié)合蛋白,其中 Cofilin被認為有著關(guān)鍵作用〔4,5〕。目前研究證明,Cofilin是 L IM激酶及 SSH磷酸酶在細胞內(nèi)惟一已知的底物。SSH由 3種基因編碼,每種都有長型和短型(長型以L表示)。3個 SSH家族磷酸酶在亞細胞分布、與肌動蛋白絲的結(jié)合活性、特異活性和組織表達方式上有所不同,SSH-1L和 SSH-2L與肌動蛋白絲緊密結(jié)合并共存。SSH-1L,連同 SSH-2L和 SSH-3L使 Cofilin去磷酸化,從而激活Cofilin,進而促進肌動蛋白絲的解聚,抑制肌動蛋白絲聚合,因而對細胞定向移動至關(guān)重要〔6～8〕。

逆轉(zhuǎn)錄病毒基因結(jié)構(gòu)簡單、易于操作,感染效率高,應(yīng)用范圍廣,是目前用于體內(nèi)外研究最有效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)之一〔9〕。逆轉(zhuǎn)錄病毒重組載體pLNCX有復(fù)制缺陷性,沒有感染能力,必須經(jīng)過包裝細胞的包裝。當逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細胞PA 317細胞后,形成只有一次感染能力的病毒顆粒。并且PA 317細胞的病毒結(jié)構(gòu)需要與載體進行 2次以上同源重組才可能產(chǎn)生野生型病毒,因而安全性較高;此外 PA 317細胞是嗜雙性的,包裝效率也高。因此,PA 317細胞已經(jīng)被廣泛運用于基礎(chǔ)研究及臨床試驗。筆者將 pLNCX-SSH-1L轉(zhuǎn)染 PA 317細胞后,獲得滴度為 5×108CFU/L的病毒上清,再用其感染骨肉瘤細胞系MG63細胞,共收集 18個克隆,隨機挑選 1、3、5號克隆擴增培養(yǎng),經(jīng) RT-PCR和W estern印跡結(jié)果證實轉(zhuǎn)染成功,免疫細胞化學測定M G63細胞感染率為 90%以上。這為研究SSH在腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制方面奠定了實驗基礎(chǔ)。

1 Pavlov D,M uhlrad A.A ctin filament severing by cofilin〔J〕.JMolB iol,

2007;365(5):1350-8.

2 W ang Y,Shibasaki F,M izuno K.Calcium signal-induced cofilin dephosphorylation ism ediated by slingshot via calcineurin〔J〕.J B io l Chem,

2005;280(13):12683-9.

3 Yam aguchiH,Condeelis J.Regu lation of the actin cyto skeleton in cancer cellm igration and invasion〔J〕.B iochim B iophysA cta,2007;1773(5):

642-52.

4 Pavlov D,M uh lrad A.A ctin filam ent severing by cofilin〔J〕.JM o lB io l,

2007;365(5):1350-8.

5 Huang TY,DerM ardirossian C.Cofilin phosphatasesand regu lation of actin dynam ics〔J〕.CurrOp in CellB io l,2006;18(1):26-31.

6 Ohta Y,Kousaka K,Nagata-Ohashi K,et al.D ifferential activity,distribution and tissue exp ression patternsof threemembersof Slingshot fam ily phosphatases thatdephosphorylate cofilin〔J〕.GenesCells,2003;8(1):11-24.

7 N ishitaM,W ang Y,Tom izawa C,et a l.Phosphoinositide 3-kinase-mediated activation of cofilin phosphatase Slingshotand its role for insu lin-inducedmembrane p rotrusion〔J〕.JB iolChem,2004;279:7193-8.

8 Huang TY,DerM ardirossian C.Cofilin phosphatases and regulation of actin dynam ics〔J〕.CurrOp in CellB iol,2006;18(1):26-31.

9 W ilson DR.V iralmediated gene transfer for cancer treatment〔J〕.Curr Pharm B iotechnol,2002;3(2):151-6.

〔2009-12-15收稿 2010-01-10修回〕

(編輯 曲 莉)

Estab lishm en t of stab le tran sfected cell line Slingshot-1L m ed ia ted by retrov ira l

ZHANGM u-Ru i,W ANG Yan,ZHAO Dong-Xu,et a l.

Key Labora tory of Pa thob io logy,M in istry of Educa tion,Schoo l of BasicM ed ica l Sc iences,Jilin Un iversity,Changchun 130021, Jilin,Ch ina

O b jective To estab lish stable transfected cell line by retroviral vector encoding Slingshot-1L.M ethods The p lasm id pLNCX-Slingshot-1L was transfected into packaging cell PA 317 by lipofectam ine.The transfectantswere selected by G418 and viral titers were analyzed.V irals supernatantwere co llected to infectMG63 sells,selected by G418.Resu lts V irals supernatantw ith high viral titers were obtained by retroviral vecto r encoding Slingsho t-1L.V irals supernatan twere co llected to infectM G63 sells,and the stab le transfected MG63 cell linewas estab lished.Conc lusion s The stab le transfected cell line over-exp ression Slingshot-1L m ediated by retroviral is established successfully.

Retrovirus vector;Stab le transfected cell line

book=492,ebook=26

Q782

A

1005-9202(2010)04-0492-03

國家863重大專項資助項目(2004AA 205020);國家自然科學基金資助項目 (30772488);吉林省科技廳重大項目(20076023)

1 吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院臨床基因診療中心

李玉林(1950-),男,教授,博士生導師,主要從事干細胞組織工程方面的相關(guān)研究。

張慕蕊(1981-),女,博士,主要從事細胞信號轉(zhuǎn)導的相關(guān)研究。