李曉江 白云深 楊有庚 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科,吉林 長(zhǎng)春 130041)

ROCK-Ⅱ基因 shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

李曉江 白云深 楊有庚 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院骨科,吉林 長(zhǎng)春 130041)

目的 構(gòu)建表達(dá)Rho激酶(ROCK)-Ⅱ特異性 siRNA的重組質(zhì)粒。方法 按照 Elbashir等設(shè)計(jì)原則和 siRNA表達(dá)載體的要求,利用Am bion公司在線 siRNA Tatget finder軟件,設(shè)計(jì)帶有BamH I、Bbs I酶切黏性末端、終止識(shí)別序列和LOOP環(huán)的 shRNA,并將其克隆入載體 pGPU 6/ GFP/Neo,構(gòu)建成ROCK-Ⅱ特異 siRNA重組質(zhì)粒,然后進(jìn)行酶切鑒定及基因測(cè)序。結(jié)果 設(shè)計(jì)的 shRNA成功克隆入載體 pGPU 6/GFP/Neo,構(gòu)建成ROCK-Ⅱ特異 siRNA重組質(zhì)粒,酶切鑒定及基因測(cè)序表明設(shè)計(jì)序列完全相符,目的基因序列準(zhǔn)確無誤。結(jié)論 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,為今后體外或體內(nèi)研究 ROCK基因在脊髓損傷后的功能修復(fù)提供了一種有效的方法。

載體構(gòu)建;RNA干擾;ROCK(Rho激酶)

RNA干擾(RNA i)是由雙鏈 RNA介導(dǎo)的、在轉(zhuǎn)錄后mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)基因表達(dá)的過程。將與靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈 RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后,生成的小干擾RNA(siRNA)與RNA i特異性酶結(jié)合,形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物,具有序列特異性核酸內(nèi)切酶活性,能特異性降解該mRNA,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失。本研究采用含 H 1啟動(dòng)子的載體 pGPU6/GFP/Neo,針對(duì) ras基因超家族中 Rho激酶(ROCK)基因的短發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA(shRNA)構(gòu)建靶向 ROCK-Ⅱ特異性 shRNA真核表達(dá)載體,為今后體外或體內(nèi)研究 ROCK基因在脊髓損傷后的功能修復(fù)提供一種有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 生化培養(yǎng)箱、震蕩培養(yǎng)箱(金壇儀器廠),熒光顯微鏡(OLYMPUS公司)。連接試劑盒、小量抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒(Q IAGEN公司),限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司)。

1.2 shRNA序列設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)pGPU 6/GFP/Neo中H 1啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá) siRNA對(duì)序列的要求,利用Am bion公司在線 siRNA Tatget finder軟件 (http://www.am bion.com/tech lib/m isc/ siRNA finder.htm l)設(shè)計(jì)合成 4條針對(duì)大鼠 ROCK序列的 siRNA DNA片段,分析獲得的序列,選擇 GC含量在 40%～55%之間的靶基因序列作為潛在優(yōu)選,并在 GenBank表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST檢索,將選定的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較,排除和其他編碼序列同源的序列,以確定其為特異性序列。為了提高序列正確退火成為雙鏈DNA分子的效率,將包含目的 siRNA序列的DNA設(shè)計(jì)為用DNA聚合酶合成的(PCR策略分別設(shè)計(jì))包含目的基因 siRNA序列的正義鏈和反義鏈寡核苷酸序列,在正義鏈和反義鏈序列加入間隔序列TTCAAGAGA,以避免形成終止信號(hào),使其能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu), shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用 T6結(jié)構(gòu)。正義鏈模板的 5′端添加了CACC,與Bbs I酶切后形成的黏端互補(bǔ);反義鏈模板的 5′端添加了 GATC,與BamH I酶切后形成的黏端互補(bǔ);如果 siRNA的第 1個(gè)堿基不是 G,則在 CACC后補(bǔ)加 1個(gè) G。隨機(jī)選取排列序列作為無干擾效果對(duì)照序列。編碼 siRNA的DNA序列由上海生工合成。4條寡核苷酸鏈及反義鏈見表 1。

表1 設(shè)計(jì)、合成的4對(duì) ROCK特異性 siRNA位點(diǎn)、寡核苷酸鏈序列及 GC含量

1.3 shRNA模板的退火 將DNA o ligo分別用 TE(pH 8.0)溶解,濃度為 100μmo l/L。取相應(yīng)的正義鏈和反義鏈 oligo溶液,按照如下配比配置退火反應(yīng)體系:10×shDNA退火緩沖液5μl,正義鏈 (100μmo l/L)5μl,反義鏈 (100μmo l/L)5μl, ddH2O 35μl,總體積 50μl。在 PCR儀上按照如下程序進(jìn)行退火處理:95℃5m in,85℃5m in,75℃5m in,70℃5m in,4℃保存。退火處理后得到濃度為 10μmo l/L的 shRNA模板。將所得模板溶液稀釋 500倍,終濃度為 20 nmo l/L,用于連接反應(yīng)。

1.4 pGPU 6/GFP/Neo載體的線性化 取 2μg pGPU 6/GFP/ Neo載體,按照如下體系進(jìn)行酶切處理:10×緩沖液 G 5μl, Bbs I2μl,BamH I2μl,pGPU 6/GFP/Neo 2μg,ddH2O 41μl,總體積50μl。37℃酶切 1 h,瓊脂糖電泳,使用 Agarose GelDNA Purification KitVer2.0(TaKaRa)回收,電泳檢測(cè)估算濃度,稀釋濃度至 50 ng/μl。

1.5 pGPU 6/GFP/Neo-shRNA載體的構(gòu)建 按照如下體系進(jìn)行載體的連接反應(yīng):10×T4連接緩沖液 2μl,pGPU 6/GFP/Neo (Bbs I+BamH I)1μl,shRNA模板 (20 nmo l/L)1μl,T4 DNA連接酶 (5 weissU/μl)1μl,ddH2O 15μl,總體積 20μl。22℃1 h,轉(zhuǎn)染到 JM 109 competent細(xì)胞。每個(gè)連接反應(yīng)挑取 5個(gè)菌落,接種到含 50μg/m l Kanam ycin的 LB培養(yǎng)集中。使用堿裂解法抽提質(zhì)粒,所得質(zhì)粒用BamH I、Pst I分別酶切鑒定。陽(yáng)性重組載體應(yīng)該可以被BamH I切開,而不能被 Pst I切開。

2 結(jié) 果

重組載體的確切鑒定 見圖 1。酶切結(jié)果表明,所有質(zhì)粒均為陽(yáng)性重組載體,每組選擇兩個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果見圖2。

圖1 重組載體的酶切鑒定

圖2 克隆測(cè)序結(jié)果

3 討 論

成年哺乳動(dòng)物脊髓損傷后軸突難以再生的一個(gè)重要原因是在局部環(huán)境中存在一些可以抑制軸突再生的生長(zhǎng)抑制因子,主要包括 3種來源于髓鞘的抑制蛋白:髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、Nogo、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白 (OMGP)〔1〕。這些抑制因子有共同的信號(hào)傳導(dǎo)通路,均可與 Nog的受體 NgR結(jié)合,在 P75的參與下激活其下游的 Rho-ROCK通路而引起生長(zhǎng)錐塌陷,抑制軸突的再生。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,ROCK是該通道的主要成分。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一,以兩種同源性極高的異構(gòu)體存在:ROCK-Ⅱ和 ROCK-I,是目前研究最為清楚的 Rho下游效應(yīng)分子。ROCKⅡ主要表達(dá)在腦內(nèi),而ROCK-I則主要表達(dá)在非神經(jīng)組織如肺、腎和骨骼肌。脊髓損傷 ROCK被激活后能夠使肌球蛋白磷酸酶磷酸化而失活,使得肌球蛋白磷酸化程度增高,從而影響肌動(dòng)-球蛋白系統(tǒng)而導(dǎo)致軸突生長(zhǎng)錐的塌陷,抑制軸突生長(zhǎng)。因此,阻斷 Rho-ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路,即可達(dá)到軸突修復(fù)與再生的目的。

抑制基因表達(dá)的方法有很多,目前研究使用較多的主要有基因敲除、反義RNA技術(shù)、RNA i技術(shù)等,其中 RNA i是最近幾年發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的一門新興的在轉(zhuǎn)錄水平上的基因阻斷技術(shù),是一種雙鏈RNA分子在mRNA水平上關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)或使其沉默的過程,也就是序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。與傳統(tǒng)的基因治療方法相比,RNA i技術(shù)有著無可比擬的優(yōu)勢(shì)〔2～5〕。首先,RNA i基因抑制效果確切,微量的 siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量下降 90%以上,這樣可減少傳統(tǒng)基因治療方法大劑量用藥帶來的毒副作用及免疫效應(yīng)。其次, RNA i抑制具有嚴(yán)格的序列特異性,將一段與基因同源的 siRNA注入細(xì)胞,可以特異地干擾相應(yīng)基因的表達(dá),而其他基因不會(huì)受到干擾,因此,RNA i治療的針對(duì)性強(qiáng),副作用小。RNA i已經(jīng)成為研究基因功能的重要工具,并將在病毒性疾病、遺傳性疾病、腫瘤和脊髓損傷的治療方面發(fā)揮重要作用〔6〕。

脊髓損傷的 RNA i是在對(duì)脊髓損傷后基因表達(dá)及產(chǎn)物研究的基礎(chǔ)上,通過選擇恰當(dāng)?shù)幕蜣D(zhuǎn)移途徑,在轉(zhuǎn)錄后沉默目的基因的表達(dá),阻斷抑制因子的作用,進(jìn)而促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù),達(dá)到在分子水平治療的目的〔7～10〕。選擇 RNA i沉默 ROCK-Ⅱ的基因表達(dá),人為阻斷 Rho-ROCK傳導(dǎo)通路,有效抑制靶基因表達(dá),使其喪失活性,達(dá)到基因控制和基因治療的目的。因此,本實(shí)驗(yàn)篩選出高沉默效率的 ROCK-Ⅱ特異性 siRNA,并構(gòu)建其表達(dá)載體,為下一步通過 RNA i技術(shù)直接抑制脊髓損傷后ROCK-Ⅱ的表達(dá)做準(zhǔn)備。

本研究所構(gòu)建的 ROCK特異性 siRNA重組質(zhì)粒 pGPU6/ GFP/Neo-shRNA,經(jīng)酶切鑒定、基因測(cè)序,結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全相符,目的基因序列準(zhǔn)確無誤,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,為進(jìn)一步研究體內(nèi)外脊髓損傷的治療奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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〔2009-11-05收稿 2009-12-30修回〕

(編輯 曲 莉)

book=30,ebook=29

Q782

A

1005-9202(2010)04-0502-03

楊有庚(1945-),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事脊柱外科疾病的診斷與治療。

李曉江(1977-),男,在讀博士,主要從事脊柱外科疾病的診斷與治療。