仇志琴李志沭黃玉政楊 歡成 勇

(南京醫(yī)科大學附屬無錫市第二人民醫(yī)院,江蘇 無錫 214002)

人乳鐵蛋白對細胞增殖的影響

仇志琴1李志沭2黃玉政1楊 歡3成 勇1

(南京醫(yī)科大學附屬無錫市第二人民醫(yī)院,江蘇 無錫 214002)

目的 探討人乳鐵蛋白(hLF)對體外培養(yǎng)細胞生長特性的影響。方法 M TT法評定 hLF對人鼻咽癌細胞、中國倉鼠卵巢細胞、人肝臟細胞的生長抑制作用。結(jié)果 乳鐵蛋白對人鼻咽癌細胞系CNE的增殖有抑制作用并呈現(xiàn)劑量依賴性,對正常細胞無抑制作用。結(jié)論 hLF可能是一種效果較好的新的抗腫瘤化學劑。

人乳鐵蛋白;癌細胞;細胞增殖

人乳鐵蛋白(Hum an Lactoferrin,hLF)是主要存在于人乳清中的球蛋白,乳汁中特別是初乳中含量最高,具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用〔1,2〕。國外有學者將其應用于腫瘤患者的治療〔3〕,但是對其作用機制的研究較少。目前國內(nèi)較少有關于hLF作用于細胞的報道,我們選用易早期轉(zhuǎn)移的鼻咽癌(NPC)細胞作為研究對象〔4〕,以中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)、人肝臟細胞(L02)作為正常細胞對照,觀察 hLF在體外是否具有抑制癌細胞生長的作用,探討 hLF抗腫瘤的作用機制,從而為腫瘤的治療提供研究基礎,為臨床實驗及應用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細胞(CNE)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、人肝臟細胞(L02)均購自中國科學院上海細胞資源中心。重組hLF(Lot:L0520,溶于 PBS中,儲存濃度 5mg/m l,-20℃儲存?zhèn)溆?和噻唑藍(M TT,Lot:M 2128)均購自 Sigma公司。RPM I1640、胎牛血清購自 HyC lone公司。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 各細胞系均應用含 10%胎牛血清和 1%青鏈霉素的 RPM I1640培養(yǎng)基,5%CO2,37℃培養(yǎng)。

1.2.2 M TT法檢測細胞增殖 設空白對照組和 hLF干預組。待細胞生長至對數(shù)生長期,接種于 96孔細胞培養(yǎng)板,接種數(shù)為5×104/孔。每組細胞設 5個平行孔,各組細胞分別加入不同濃度的 hLF(0,1.25×10-3,2.5×10-3,5×10-3,10×10-3, 20×10-3,40×10-3g/L),每孔均為 200μl。作用 24 h后,加入M TT(5 g/L,每孔 20μl),繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,測定A 570 nm吸光度。1.2.3 細胞形態(tài)觀察 細胞經(jīng) hLF處理后,傾去上層懸浮死細胞并用 PBS洗兩遍,加入新鮮培養(yǎng)基。同樣處理對照孔細胞,將細胞置于倒置顯微鏡下,觀察細胞形態(tài)的變化。

2 結(jié) 果

2.1 重組 hLF對鼻咽癌細胞 CNE、人肝臟細胞L02、中國倉鼠細胞CHO系的增殖能力的影響 對CNE呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制作用,而對正常細胞無抑制作用,見表 1。

表 1 人乳鐵蛋白對各細胞體外增殖的影響(±s)

表 1 人乳鐵蛋白對各細胞體外增殖的影響(±s)

與空白對照比較:1)P<0.05

hLF劑量(g/L) CNE細胞系 L02細胞系 CHO細胞系0 2.795±0.05 1.900±0.05 2.312±0.15 1.25×10-32.488±0.10 1.810±0.10 2.229±0.05 2.5×10-32.512±0.21 1.792±0.14 2.230±0.10 5×10-32.001±0.051)1.800±0.03 2.152±0.04 10×10-31.810±0.151)1.716±0.30 2.178±0.10 20×10-31.665±0.041)1.780±0.30 2.155±0.05 40×10-31.300±0.051)1.690±0.15 2.104±0.18

2.2 細胞形態(tài)學觀察 顯微鏡鏡下可見,空白對照組癌細胞密集成片生長,如鋪路卵石狀,細胞膜圓潤,透明,顆粒較少,細胞間界限清楚,并可隱約見到細胞核。hLF處理組癌細胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變,隨 hLF濃度增加,細胞從正常的增殖旺盛的貼壁生長,逐漸表現(xiàn)為生長緩慢,黏附力降低,細胞變圓,細胞胞質(zhì)粗糙,細胞內(nèi)顆粒逐漸增多,且透明度降低,立體感較差,細胞形態(tài)完整性受損,而正常細胞在hLF作用下無顯著變化 (見圖 1)。

圖1 細胞鏡檢圖

3 討 論

hLF多種生物學功能通過免疫系統(tǒng)的激活與調(diào)節(jié)得以實現(xiàn)〔5〕。Bezaul〔6〕研究發(fā)現(xiàn),乳鐵蛋白能抑制鼠實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤內(nèi)注射LF,可以明顯的減小實體瘤的體積,且作用效果與 LF干預天數(shù)相關。研究〔7,8〕發(fā)現(xiàn),乳鐵蛋白的抗頭頸部腫瘤作用是通過抑制腫瘤細胞增殖實現(xiàn)的。W o lf〔3〕等發(fā)現(xiàn),人乳鐵蛋白通過阻斷頭頸部腫瘤細胞由 G0到 G1期的轉(zhuǎn)化來抑制腫瘤細胞的增殖。人乳鐵蛋白對鼠的 SCC細胞系生長的抑制作用,與劑量成正相關;而且人乳鐵蛋白抑制頭頸部細胞癌的作用是通過直接的細胞毒作用及系統(tǒng)性的免疫調(diào)節(jié)作用實現(xiàn)的。Varadhachary〔9〕等人做了大量的口服臨床試驗,證實乳鐵蛋白無藥物相關的有害作用。鼻咽癌作為頭頸部腫瘤之一,其惡性程度較高〔4〕,早期即可出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,臨床上有轉(zhuǎn)移至骨盆、肺、肝等多器官的病例〔10〕。選用鼻咽癌細胞作為研究對象,具有一定的代表意義。

本研究結(jié)果顯示,人乳鐵蛋白可以抑制鼻咽癌細胞增殖,且呈劑量依賴性,對正常細胞的增殖無明顯抑制作用。這一結(jié)果,為開發(fā)乳鐵蛋白的抗癌功效提供了理論依據(jù)。

1 曹勁松 .初乳功能性食品〔M〕.北京:中國輕工業(yè)出版社,2000:1-10.

2 黃玉政,成 勇,柏亞軍,等 .人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠雜交選育的研究〔J〕.動物醫(yī)學進展,2007;28(6):39-43.

3 W olf JS,L i GY,Varadhachary A,et a l.O ral lactoferrin results in T cell dependent tumor inhibition of head and neck squamous cell carcinoma in vivo〔J〕.C lin Cancer Res,2007;13(5):1601-10.

4 張本華 .臨床腫瘤學〔M〕.北京:科學技術文獻出版社,2007:30-40.

5 CumberbatchM,Dearman RJ,U ribe-Luna S,et a l.Regulation of ep iderm alLangerhans cellm igration by lactoferrin〔J〕.Immunology,2000;100 (1):21-8.

6 Bezault J,Bhimani R,W ipm vnick J,et a l.Human lactoferrin inhibits grow th of solid tumors and development of experim entalmetastases in m ice〔J〕.CancerRes,1994;54(9):2310-2.

7 X iao Y,M onitto CL,M inhas KM,et a l.Lac toferrin dow n regu lates G1 cyclin-dependen t kinasesduring grow th arrestof head and neck cancer cells〔J〕.Clin Cancer Res,2004;10(23):8683-6.

8 Dam iens E,Elyazid i I,M azu rier J,eta l.Lactoferrin inhibitsG1 cyclin-dependent kinases du ring grow th arrest of hum an breast carcinom a〔J〕.J CellB iochem,1999;74(3):486-98.

9 Varadhachary A,W o lf JS,Petrak K,et a l.O ral lactoferrin inhibits grow th of estab lished tumo rsand poten tiatesconventionalchemotherapy〔J〕.Int J Cancer,2004;111(3):398-403.

10 蘇沛珠,黃 泳 .鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關分子標志物的研究進展〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)生,2009;47(3):50-2.

〔2009-02-16收稿 2009-10-30修回〕

(編輯 賈春澍/張 慧)

Study on inh ib ition of lactoferr in on prolifera tion of cells in v itro

Q IU Zh i-Q in,L IZh i-Shu,HUANG Y u-Zheng,et a l.

The Second Hosp ita l ofW ux i,A ffilia ted to Nan jingM ed ica l Un iversity,W ux i214002,Jiangsu,Ch ina

O b jective To exp lore the effectof lactoferrin on p ro liferation of the cu ltured cells in vitro.M ethods M TT assaywas used to evaluate the grow th inhibition effectof lactoferrin on CNE,L02 and CHO cell lines.Resu lts Lactoferrin significantly inhibited the p ro liferation of CNE cells in a dose-dependentm anner,but had no effect on the norm al cells.Conc lusion s Lactoferrin as a new cancer chemo-p reventive agent cou ld significantly inhibit the grow th of carcinom a cells.

Hum an lactoferrin;Carcinom a cells;Cellp ro liferation

book=30,ebook=24

R-331

A

1005-9202(2010)04-0504-02

江蘇省 135重點實驗室開放課題(W K0511);江蘇省衛(wèi)生廳科研項目(X2007036)

1 揚州大學江蘇省轉(zhuǎn)基因制藥工程研究中心

2 江蘇省沭陽人民醫(yī)院 3 蘇州大學附屬第二醫(yī)院

成 勇(1956-),男,教授,博士生導師,主要從事胚胎工程與轉(zhuǎn)基因研究。

黃玉政(1982-),男,碩士,助理研究員,主要從事胚胎工程與轉(zhuǎn)基因研究。

仇志琴(1982-),女,住院醫(yī)師,主要從事臨床婦產(chǎn)醫(yī)學與生殖醫(yī)學等工作。