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        聚維酮碘栓微生物限度檢查法驗證試驗

        2010-08-28 03:32:14丘展鋒黃國玉
        中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用 2010年14期
        關(guān)鍵詞:試液菌液瓊脂

        丘展鋒 黃國玉

        建立聚維酮碘栓微生物限度檢查方法,并對該法的有效性進(jìn)行評價。通過試驗確定了聚維酮碘栓的微生物限度檢查方法。

        1 材料與方法

        1.1 培養(yǎng)基及試劑 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基;改良馬丁液體培養(yǎng)基;改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基;玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;無菌硫代硫酸鈉滴定液(0.1 mol/L);0.9%無菌氯化鈉溶液;pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液;膽鹽乳糖培養(yǎng)基;甘露醇高鹽瓊脂平板,十六烷三甲基溴化銨平板。陽性對照菌:大腸埃希[cMcc(B)44102],金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003],枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501],銅綠假單孢菌[ECMCC(B)10104],白色念珠菌[CMCC(F)98001],黑曲霉菌[CMCC(F)98003](菌種均由中國藥品生物制品檢定所提供)。

        1.2 供試品聚維酮碘栓,廣東慶發(fā)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

        2 陽性對照菌液的制備

        取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,35℃ 下培養(yǎng)18 h,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 ml中含菌數(shù)約為50~100 cfu的陽性對照菌液備用;另取白色念珠菌的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于改良馬丁液體培養(yǎng)基中,25℃ 下培養(yǎng)24 h,用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每1 ml中含菌數(shù)約為50~100 cfu的陽性對照菌備用;取黑曲霉斜面培養(yǎng)物,至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)5~7 d,加3~5 ml0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子,吸取出菌液,用0.9%氯化鈉溶液稀釋至每1 ml含菌數(shù)約為50~100 cfu的陽性對照菌備用。

        3 預(yù)試驗

        常規(guī)檢查法檢查供試品對各種菌株的抑菌程度取供試品10 g用45℃ pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml,振搖溶解,作為1:10的供試液,取該供試液各lml,分別注入平皿,再分別加入“2.”項下對照菌液大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各1 ml,傾注相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)后,計數(shù)。結(jié)果見表1。

        檢驗結(jié)果表明聚維酮碘栓對細(xì)菌、霉菌及酵母菌都具有較強(qiáng)的抑菌作用,故不能用常規(guī)的微生物限度檢查法檢查聚維酮碘栓的微生物限度。用薄膜過濾法需要用大量的沖洗液,最后我們選用了中和法進(jìn)行驗證。

        4 驗證

        4.1 方法與結(jié)果

        4.1.1 供試液制備方法 取供試品10 g,加至45℃含30 ml無菌水的三角燒杯中,充分振搖,使供試品溶解。然后加10 ml無菌硫代硫酸鈉滴定液(0.1 mol/L),再用45℃的pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml,振搖5~10 min,作為1:10的供試液。

        表1 常規(guī)檢查法檢查供試品對各種菌株的抑菌程度試驗結(jié)果(株,%)

        4.1.2 檢查方法驗證

        4.1.2.1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌菌數(shù)測定方法的驗證(陽性菌回收率試驗)菌數(shù)測定所用培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度,培養(yǎng)時間:加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及相應(yīng)空白組傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,30℃ ~35℃培養(yǎng)48 h;加入白色念珠菌、黑曲霉及相應(yīng)空白組傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基20℃ ~25℃培養(yǎng)72 h。

        ①陽性對照菌液組:取“2”項下的對照菌液大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各1 ml,分別注入平皿,傾注相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)后,計數(shù)。結(jié)果見表2;②稀釋液對照組:取45℃含30 ml無菌水的三角燒杯,然后加入10 ml無菌硫代硫酸鈉滴定液(0.1 mol/L),再用45℃的pH7.0無菌氯化鈉一蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml,振搖5~10 min,作為1:10的供試液。取該供試液各lml分別注入平皿再分別加入“2”項下的對照菌液大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各lml,傾注相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)后,計數(shù)。結(jié)果見表2;③供試品對照組:取“4.1.1”制備的供試液各lml,分別注入平皿,傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后,計數(shù)。結(jié)果(見表2);④供試品試驗組:取“4.1.1”制備的供試液各lml,分別注入平皿,再分別加入“2”項下對照菌液大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各1 ml,傾注相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)后,計數(shù)。結(jié)果見表2。

        以上各組每次試驗用2個平皿,試驗重復(fù)3次。

        表2 各菌種試驗結(jié)果

        4.1.2.2 控制菌檢查方法的驗證

        ①金黃色葡萄球菌檢查方法的驗證:控制菌測定所用培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度,培養(yǎng)時間:加金黃色葡萄球菌至100 ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng),置35℃培養(yǎng)24 h后,劃線于甘露醇高鹽瓊脂平板,置35℃培養(yǎng)24 h。

        陽性對照組 取“2.”項下對照菌液金黃色葡萄球菌1 ml,加入含有100 ml營養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中培養(yǎng),劃線培養(yǎng),觀察。結(jié)果見表3。

        陽性試驗組取“4.1.1.”制備的供試液10 ml,接種于含有100 ml營養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中,再加入“2.”項下對照菌液金黃色葡萄球菌培養(yǎng),劃線培養(yǎng),觀察。結(jié)果見表3。

        供試品對照組 取“4.1.1.”制備的供試液10 ml,接種于含有100 ml營養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)基中培養(yǎng),觀察。結(jié)果見表3。

        ②銅綠假單孢菌檢查方法的驗證:控制菌測定所用培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度,培養(yǎng)時間:加銅綠假單胞菌至100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng),置35℃培養(yǎng)24 h后,劃線于十六烷三甲基溴化銨平板,置35℃培養(yǎng)24 h。

        陽性對照組取“2.”項下對照菌液銅綠假單胞菌1 ml,加入含有100 ml膽鹽乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng),劃線培養(yǎng),結(jié)果見表3。

        陽性試驗組取“4.1.1.”制備的供試液10 ml,接種于含有100 ml膽鹽乳糖的培養(yǎng)基中,再加入“2.”項下對照菌液銅綠假單胞菌培養(yǎng),劃線培養(yǎng),觀察。結(jié)果見表3。

        供試品對照組取“4.1.1.”制備的供試液10 ml,接種于含有100 ml膽鹽乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng),觀察。結(jié)果見表3。

        以上各組試驗每次平行測定2次,試驗重復(fù)3次。

        表3 控制菌檢查方法驗證結(jié)果

        5 討論

        《中國藥典》(2005年版)規(guī)定微生物限度檢查法結(jié)果判定在3次獨立的平行試驗中,稀釋液對照組及試驗組細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法驗證的回收率應(yīng)不低于70%,低于70%則表明該樣品有抑菌作用。控制菌檢查方法驗證時,陽性對照菌應(yīng)檢出,陰性對照菌不得檢出。如驗證結(jié)果達(dá)不到規(guī)定,應(yīng)采用其他方法消除供試品的抑菌活性,并對方法重新進(jìn)行驗證。

        從以上結(jié)果可以看出,該試驗方法達(dá)到《中國藥典》(2005年版)的規(guī)定要求。

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