林軍, 廖鮮艷＊, 堵國成, 陳堅(jiān)

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

提高耦合系統(tǒng)A TP再生效率促進(jìn)谷胱甘肽合成的研究

林軍1,2, 廖鮮艷＊1,2, 堵國成1,2, 陳堅(jiān)1,2

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

利用重組Escherichia coliΔadd/ade(pBV03)和S accharomyces cerevisiaeWSH2構(gòu)建了一個(gè)生物合成谷胱甘肽(GSH)的種間耦合系統(tǒng)。在該耦合系統(tǒng)中,一方面,大腸桿菌腺苷脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶的缺失完全切斷了E.coliΔadd/ade(pBV03)中不可逆轉(zhuǎn)化腺苷(Ado)生成次黃嘌呤(Hx)的途徑;另一方面,利用脯氨酸限制性培養(yǎng)降低了釀酒酵母WSH2中ADE的活性,進(jìn)一步降低了耦合系統(tǒng)中從Ado到Hx的不可逆轉(zhuǎn)化。以上兩方面大大降低了耦合系統(tǒng)中從Ado到Hx的不可逆轉(zhuǎn)化,從而保證更多的底物Ado被S.cerevisiaeWSH2用于再生ATP,最終耦合系統(tǒng)中A TP再生的效率大大提高。反應(yīng)6 h后,該耦合系統(tǒng)GSH的合成量達(dá)到13.68 mmol/L,為對照的5.14倍。

谷胱甘肽;生物合成;耦合系統(tǒng);大腸桿菌;釀酒酵母

谷胱甘肽(GSH)是廣泛存在于動(dòng)、植物及微生物細(xì)胞內(nèi)的一種小分子巰基化合物,具有保護(hù)細(xì)胞免受重金屬侵害、維持胞內(nèi)氧化還原平衡和輔助蛋白質(zhì)復(fù)性等重要的生理功能[1-2]。近年來,GSH廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等工業(yè),需求量日益增加,我國GSH工業(yè)化生產(chǎn)呈空白狀態(tài)[3-4]。

谷胱甘肽在生物體內(nèi)是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(EC 6.3.2.2,GSH I)和GSH合成酶(EC 6.3.2.3,GSH II)在ATP存在的條件下,催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸進(jìn)行序貫反應(yīng)而形成的[5]。因此,滿足ATP的有效供給是實(shí)現(xiàn)酶法合成GSH的一個(gè)必需條件。由于ATP價(jià)格昂貴,直接添加A TP大大增加了酶法合成GSH的成本;同時(shí),高濃度的ATP及其代謝產(chǎn)物ADP也抑制GSH合成酶的活性,由此導(dǎo)致GSH的酶法生產(chǎn)至今未能實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。但是,這些問題可以通過在酶法合成GSH的過程中構(gòu)建一個(gè)ATP再生的系統(tǒng)來解決[6]。ATP再生系統(tǒng)可定義為一個(gè)消耗A TP的酶催化體系和一個(gè)生物合成ATP的體系所構(gòu)成的耦合系統(tǒng)[7]。

在前期的研究中,構(gòu)建了一系列由重組大腸桿菌(Escherichia coli)和釀酒酵母(S accharomyces cerevisiae)組成的A TP再生系統(tǒng)用于生物合成GSH[8-10]。一方面,釀酒酵母中的糖酵解途徑以腺苷(Ado)為底物合成ATP,Ado在腺苷激酶和腺苷酸激酶的催化下生成ADP,ADP進(jìn)一步通過底物磷酸化轉(zhuǎn)化為ATP,此過程需要消耗葡萄糖[11]。另一方面,消耗釀酒酵母合成的ATP,高效表達(dá)GSH合成酶系的重組大腸桿菌利用3種前體氨基酸合成GSH,此過程中ATP的代謝產(chǎn)物ADP和Ado可再次被釀酒酵母用來合成ATP。然而,對耦合系統(tǒng)中嘌呤核苷酸代謝分析結(jié)果表明,重組大腸桿菌中腺苷脫氨酶(EC 3.5.4.4,ADA)和腺嘌呤脫氨酶(EC 3.5.4.2,ADE)迅速將底物Ado不可逆轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤(Hx),導(dǎo)致釀酒酵母不能獲得合成ATP的前體腺嘌呤核苷(酸),從而無法實(shí)現(xiàn)耦合系統(tǒng)的ATP再生,這是耦合系統(tǒng)ATP再生效率低下的根本原因[8-9]。此外,釀酒酵母中存在的ADE加劇了從Ado到Hx的不可逆轉(zhuǎn)化,見圖1。因此,如果能采取合適的手段消除大腸桿菌中的ADA和ADE以及釀酒酵母中的ADE,那么耦合系統(tǒng)中從Ado向Hx的不可逆轉(zhuǎn)化途徑將被切斷,從而保證更多的底物Ado被釀酒酵母用來再生ATP,那么耦合系統(tǒng)的ATP再生效率將明顯提高, GSH的合成量也將相應(yīng)增加。

圖1 用于GSH合成的重組大腸桿菌和釀酒酵母耦合ATP再生系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of GSH production and ATP regeneration by the coupled system

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 釀酒酵母S.cerevisiaeWSH2:作者所在研究室保存菌株;質(zhì)粒pBV03(包含兩拷貝的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因和單拷貝的GSH合成酶基因):由作者所在實(shí)驗(yàn)室廖鮮艷博士構(gòu)建[12];大腸桿菌E.coliBW25113、E.coliJ W1615、E.coliJ W3640和質(zhì)粒p KD46:購自美國耶魯大學(xué)大腸桿菌保藏中心[13];重組大腸桿菌E. coliΔadd/ade(pBV03):作者構(gòu)建。

1.1.2 試劑 三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、單磷酸腺苷(AMP)、腺苷(Ado)、腺嘌呤(Ade)、肌苷(Ino)、和次黃嘌呤(Hx):Sigma-Aldrich上海公司產(chǎn)品;GSH還原酶、NADPH和5,5′-二硫雙-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)等:Sigma-Aldrich上海公司產(chǎn)品;脯氨酸(Proline)、Taq DNA聚合酶、卡那霉素、氨芐青霉素、引物、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒:Sangon上海公司產(chǎn)品;酵母粉和胰蛋白胨:Oxoid公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建腺苷脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶雙基因突變株E.coliΔadd/ade(pBV03) 參照Datsenko和Wanner[14]的方法,敲除腺苷脫氨酶(ADA)突變株(E.coliJ W1615)中的腺嘌呤脫氨酶(ADE)基因以構(gòu)建add/ade雙基因缺失菌株(E.coliΔadd/ade)。首先將表達(dá)Red重組酶的質(zhì)粒p KD46導(dǎo)入E.coliJ W1615,在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB(酵母粉5 g/L,胰蛋白胨10 g/L, NaCl 10 g/L)固體平板上篩選轉(zhuǎn)化子(培養(yǎng)溫度為30℃)。然后制備用于電轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞,當(dāng)菌體OD600達(dá)到0.2時(shí),加入1 mmol/L L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red重組酶,誘導(dǎo)時(shí)間不少于1 h,OD600約為0.6時(shí)收獲菌體,制備感受態(tài)細(xì)胞。利用電轉(zhuǎn)化法將用于同源重組的片段導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。用于同源重組的片段是以A1(5’-GA GGATTTGCGGGTTCACA-3’)和A2(5’-TGGCGATTCA GGGCTTTAC-3’)為引物,以大腸桿菌ADE突變株E.coliJ W3640的染色體基因?yàn)槟０?獲得含有卡那霉素抗性的PCR片段。然后,迅速向電轉(zhuǎn)后的感受態(tài)細(xì)胞中加入1 mL LB(酵母粉5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,p H 7.0)培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)1 h后升溫至42℃培養(yǎng)1 h。最后,取適量培養(yǎng)后的菌液涂布于含有25 mg/L卡那霉素的LB固體平板。次日,通過點(diǎn)種試驗(yàn)選擇具有卡那霉素抗性但不具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子,以A1和A2為引物,通過PCR片段的大小驗(yàn)證腺嘌呤脫氨酶基因的缺失。最后,通過電轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pBV03導(dǎo)入重組大腸桿菌Δadd/ade中用于GSH的生物合成。

1.2.2 重組大腸桿菌的培養(yǎng) 從固體LB(酵母粉5 g/L,胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,瓊脂2 g/dL,p H 7.0)培養(yǎng)基上挑取單菌落接種至裝有20 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30℃、200 r/min下培養(yǎng)10～14 h。將培養(yǎng)好的種子液按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種至裝有100 mL LB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵溫度30℃,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,當(dāng)菌體培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期時(shí),迅速轉(zhuǎn)至42℃搖床,誘導(dǎo)培養(yǎng)3～5 h。發(fā)酵液經(jīng)4800g離心后,再用冰冷的20 mmol/L磷酸鉀緩沖液洗滌2次,得到的濕菌體在-80℃下保存,以用于后續(xù)生物合成GSH的研究。各培養(yǎng)基中根據(jù)需要添加100 mg/L氨芐青霉素。

1.2.3 釀酒酵母WSH2的培養(yǎng) 接種后的斜面(8°P麥汁,瓊脂2 g/dL,p H 5.5)置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,冰箱冷藏室中保藏,每月至少轉(zhuǎn)接一次。將斜面種子于30℃活化3～4 h,取一環(huán)菌體接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母膏10 g/L,p H 5.5)的500 mL三角瓶中培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,溫度30℃,培養(yǎng)時(shí)間20 h。將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按照體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖25 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母膏10 g/ L,p H 5.5)的500 mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵18 h,發(fā)酵溫度30℃,搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。發(fā)酵液經(jīng)3 000g離心后再用20 mmol/L磷酸鉀緩沖液洗滌2次,得到的濕酵母細(xì)胞在-80℃下保藏,備用。脯氨酸基本培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[15],脯氨酸的添加量為2 g/L。

1.2.4 重組大腸桿菌對外加Ado和ATP的代謝實(shí)驗(yàn) 稱取200 mg新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌菌體,加入2 mL含有5 mmol/L Ado(或A TP)的磷酸鉀緩沖液(p H 7.0),加入體積分?jǐn)?shù)0.5%的甲苯進(jìn)行通透性處理,37℃、150 r/min振蕩反應(yīng)20 min (ATP代謝實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2 h)。反應(yīng)完成后,將反應(yīng)液置于沸水浴中加熱10 min終止反應(yīng),10 000 r/min離心,得到的上清液稀釋后用作腺嘌呤核苷酸類物質(zhì)的分析檢測。

1.2.5 釀酒酵母WSH2對外加Ado和Ade的代謝實(shí)驗(yàn) 稱取400 mg新鮮培養(yǎng)的釀酒酵母菌體,加入2 mL含有10 mmol/L Ado(或Ade),400 mmol/L葡萄糖,10mmol/LAdo,1mmol/L AMP,0.1mmol/LNAD,30mmol/LMgCl2·6H2O的150 mmol/L磷酸鉀緩沖液(p H 7.0),加入體積分?jǐn)?shù)0.5%的甲苯進(jìn)行通透性處理,37℃、150 r/min振蕩反應(yīng)2 h。反應(yīng)完成后將反應(yīng)液置于沸水浴中加熱10 min終止反應(yīng),10 000 r/min離心,上清液經(jīng)稀釋后用作腺嘌呤核苷酸類物質(zhì)的分析檢測。

1.2.6 耦合系統(tǒng)合成GSH的反應(yīng)體系 耦合系統(tǒng)基礎(chǔ)反應(yīng)液組成(mmol/L):葡萄糖400,Ado 10, AMP 1,NAD 0.1,MgCl2·6H2O 30,L-Glu 60,LCys 25,Gly 25,磷酸鉀緩沖液(p H 7.0)150,用2 mol/L KOH溶液調(diào)節(jié)p H 7.0。稱取解凍的重組大腸桿菌濕菌體(反應(yīng)體系中濕菌體質(zhì)量濃度為200 mg/mL)和解凍的酵母濕菌體(反應(yīng)體系中濕菌體質(zhì)量濃度為200 mg/mL),加入耦合系統(tǒng)基礎(chǔ)反應(yīng)液,加入體積分?jǐn)?shù)0.5%的甲苯,37℃、150 r/min下振蕩反應(yīng)6 h,樣品于沸水浴中加熱終止反應(yīng),離心收集上清液,將上清液稀釋一定的倍數(shù),測定上清液中GSH和ATP及其相關(guān)物質(zhì)。

1.2.7 谷胱甘肽測定 采用DTNB(5,5’-二硫雙-(2-硝基苯甲酸))-GSH還原酶循環(huán)法[16]。在2 mL比色皿中順序加入100μL、6 mmol/L DTNB,700μL、0.3 mmol/L NADPH和200μL適當(dāng)濃度的樣品,室溫下加入100μL、50 U/mL谷胱甘肽還原酶用以啟動(dòng)測定反應(yīng),在412 nm下,測定反應(yīng)體系的起始OD值以及90 s后的OD值,根據(jù)OD值的變化速率與GSH標(biāo)樣質(zhì)量濃度關(guān)系計(jì)算出樣品中的GSH質(zhì)量濃度。

1.2.8 ATP及其相關(guān)物質(zhì)測定 采用高效液相色譜測定(HPLC)[17]。色譜條件如下:柱子為Hypersil ODS,4.6 mm×200 mm;柱溫35℃;檢測器UV 254 nm;流動(dòng)相A為0.1 mmol/L KH2PO4,2 mol/LKOH調(diào)p H 7.0。流動(dòng)相B為100% CH3OH,梯度洗脫為:0～5 min,100%A,流速1 mL/min;5～25 min,90%A,10%B,流速1.5 mL/ min。

2 結(jié)果與討論

2.1 構(gòu)建重組大腸桿菌Δadd/ade(pBV03)

將用于同源重組的片段導(dǎo)入含有質(zhì)粒p KD46的E.coliJ W1615感受態(tài)細(xì)胞中,在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的Red重組酶的作用下,E.coliJ W1615染色體中的ade基因與重組片段發(fā)生同源重組,從而被卡那霉素抗性基因替代。以A1和A2為引物對,以E.coliJ W1615(add-)、E.coliJ W3640(ade-)和E.coliΔadd/ade的染色體基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR時(shí),它們的PCR片段長度依次為2.6、2.2、2.2 kb。電泳結(jié)果表明,E.coliJ W1615染色體中的ade基因已成功被用于同源重組的卡那霉素抗性基因取代。同時(shí),PCR產(chǎn)物經(jīng)Sangon(上海)測序后表明,其序列與設(shè)計(jì)的一致,由此確證重組E.coliΔadd/ade構(gòu)建成功,見圖2。

2.2 重組大腸桿菌Δadd/ade(pBV03)對外加Ado和ATP的代謝

圖2 大腸桿菌add/ade雙突變株的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR verification ofE.coliΔadd/ade

作者前期的研究[9]表明,腺苷脫氨酶(ADA)的缺失可以切斷大腸桿菌將腺苷(Ado)經(jīng)肌苷(Ino)向次黃嘌呤(Hx)不可逆轉(zhuǎn)化的途徑,但是由于從Ado經(jīng)腺嘌呤(Ade)向Hx轉(zhuǎn)化途徑的存在,導(dǎo)致Ado依然可以轉(zhuǎn)化為Hx。腺苷脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶(ADE)的同時(shí)缺失將有可能完全切斷大腸桿菌中從Ado到Hx的轉(zhuǎn)化途徑。為此檢測了E.coliΔadd/ade(pBV03)對5 mmol/L外加Ado的代謝產(chǎn)物。從圖3可以看出,當(dāng)以Ado為底物時(shí),反應(yīng)20 min后,仍有48.6%的Ado未被轉(zhuǎn)化,Ado的主要轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為ADP和Ade,反應(yīng)體系中未檢測到肌苷(Ino)和Hx的生成。與之相比,大腸桿菌BW25113在20 min內(nèi)可以將62.9%的Ado不可逆轉(zhuǎn)化為Hx[9]。在用于生物合成GSH的種間耦合系統(tǒng)中,大腸桿菌的主要功能為消耗釀酒酵母合成的ATP,并利用其自身表達(dá)的GSH合成酶系催化3種前體氨基酸來生物合成GSH。因此,進(jìn)一步檢測了E.coliΔadd/ade(pBV03)對5 mmol/L外加A TP的代謝情況。從圖3可以看出,反應(yīng)2 h后,ATP的主要代謝產(chǎn)物為ADP、AMP、Ade和Ado,未生成Ino和Hx。以上結(jié)果表明,在E.coliΔadd/ade(pBV03)中,從Ado到Hx的不可逆轉(zhuǎn)化完全被切斷,大腸桿菌利用ATP后的代謝產(chǎn)物均為可被釀酒酵母用來再生ATP的底物。因此。以此菌株構(gòu)建種間耦合系統(tǒng),其ATP的再生效率將明顯提高。

圖3 重組大腸桿菌Δadd/ade(pBV03)對Ado和ATP的代謝Fig.3 Ado and ATP metabolisms byE.coliΔadd/ade (pBV03)

2.3 釀酒酵母WSH2對外加Ado和Ade的代謝

大腸桿菌ADA和ADE的缺失完全消除了其自身將Ado(或ATP)不可逆轉(zhuǎn)化為Hx的能力,E.coliΔadd/ade(pBV03)利用ATP后的主要代謝產(chǎn)物為Ade和Ado。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了作為種間耦合系統(tǒng)組成之一的S.cerevisiaeWSH2對Ado和Ade的代謝情況。從圖4可以看出,反應(yīng)2 h后,約88%的底物Ado被S.cerevisiaeWSH利用并轉(zhuǎn)化為AMP、ADP和ATP,反應(yīng)體系中檢測不到Ino和Hx的生成。由此可知,雖然有少量關(guān)于S.cerevisiaeWSH2中存在ADA的報(bào)道[18],但是本研究所構(gòu)建的反應(yīng)體系中ADA的活性極低,其對Ado的降解作用可以忽略,這一點(diǎn)與Deeley[19]的研究結(jié)果一致。此外,在反應(yīng)過程中也未檢測到Ade的生成,這說明S.cerevisiaeWSH2并不具備將底物Ado轉(zhuǎn)化為Ade的代謝途徑。然而,當(dāng)以Ade為底物反應(yīng)2 h后,反應(yīng)體系中除了檢測到ATP、ADP和AMP外,還檢測到Hx(1.97 mmol/L)和Ino(0.67 mmol/L),約20%的Ade不可逆轉(zhuǎn)化為Hx,由此確證了釀酒酵母中存在ADE。綜上所述,與大腸桿菌類似,釀酒酵母中也存在ADE,其催化Ade不可逆轉(zhuǎn)化為Hx,但是,釀酒酵母中ADA的活性極低,其對Ado的降解可以忽略。

圖4 釀酒酵母WSH2對Ado和Ade的代謝Fig.4 Ado and Ade metabolisms byS.cerevisiaeWSH2

盡管S.cerevisiaeWSH2不具備將Ado轉(zhuǎn)化為Ade的能力,但是重組E.coliΔadd/ade(pBV03)可以催化Ado生成Ade,此時(shí),釀酒酵母中的ADE便可催化Ade不可逆轉(zhuǎn)化為Hx,從而減少了可以用于再生ATP的底物Ado和Ade。因此,在重組E.coliΔadd/ade(pBV03)和S.cerevisiaeWSH2構(gòu)建的生物合成GSH的耦合系統(tǒng)中,如果可以消除或抑制釀酒酵母中ADE對Ade的降解作用,那么將有更多的Ado和Ade可用來再生A TP,耦合系統(tǒng)的ATP再生效率將進(jìn)一步提高,GSH的產(chǎn)量也會(huì)相應(yīng)增加。Deeley[19]的研究表明,生長在脯氨酸為惟一氮源的基本培養(yǎng)基中的釀酒酵母,其ADA的活性比生長于完全培養(yǎng)基中的釀酒酵母降低了約7倍。據(jù)此,作者采用培養(yǎng)于脯氨酸基本培養(yǎng)基中的S.cerevisiaeWSH2和重組E.coliΔadd/ade(pBV03)構(gòu)建新的耦合系統(tǒng),并考察了該耦合系統(tǒng)中的ATP代謝情況。從圖5可以看出,反應(yīng)6 h后,其Hx的生成量比對照(生長于完全培養(yǎng)基中的S.cerevisiaeWSH2組成的耦合系統(tǒng))低46.7%,而Ade的量要高162.1%。結(jié)果表明,抑制釀酒酵母中腺嘌呤脫氨酶活性可以明顯降低耦合系統(tǒng)中從Ade到Hx的不可逆轉(zhuǎn)化。

圖5 生長于完全培養(yǎng)基和脯氨酸基本培養(yǎng)基的S.cerevisiaeWSH2中ATP代謝的比較Fig.5 Comparision of ATP metabolism ofS.cerevisiae WSH2 cultured in the complete medium and the proline minimal medium

2.4 耦合系統(tǒng)合成GSH能力的比較

從圖6可以看出,反應(yīng)6 h后,由E.coliΔadd/ ade(pBV03)和S.cerevisiaeWSH2組成的耦合系統(tǒng)合成GSH的量為10.95 mmol/L,與E.coliBW25113(pBV03)和S.cerevisiaeWSH2組成的耦合系統(tǒng)相比,提高了3.12倍。眾所周知,每合成1 mol/L GSH需要消耗2 mol/L ATP,因此要合成10.95 mmol/L GSH至少需要消耗21.90 mmol/L ATP,這遠(yuǎn)高于起始添加的10 mmol/L Ado可合成的ATP。由此可知,在E.coliΔadd/ade(pBV03)和S.cerevisiaeWSH2組成的耦合系統(tǒng)中,ATP再生反應(yīng)得以建立。該耦合系統(tǒng)中ATP再生效率和GSH產(chǎn)量的提高是由于大腸桿菌ADA和ADE的缺失切斷了從Ado到Hx的不可逆轉(zhuǎn)化途徑,從而保證有更多的底物Ado和Ade用于再生A TP。在此基礎(chǔ)上,利用脯氨酸限制性培養(yǎng)來降低S.cerevisiaeWSH2中腺嘌呤脫氨酶的活性,從而進(jìn)一步降低了底物Ado經(jīng)Ade到Hx的降解,進(jìn)而增強(qiáng)了耦合系統(tǒng)中ATP再生的效率,由此低ADE活性的釀酒酵母和E.coliΔadd/ade(pBV03)組成的耦合系統(tǒng)在6 h內(nèi)合成13.68 mmol/LGSH,相比于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的S.cerevisiaeWSH2構(gòu)建的耦合系統(tǒng)提高了24.9%,為初始耦合系統(tǒng)的5.14倍。

圖6 耦合系統(tǒng)合成GSH的能力比較Fig.6 Comparision of GSH production by the coupled system

3 結(jié) 語

A TP的有效供給是實(shí)現(xiàn)酶法合成GSH的必需條件之一。在由重組大腸桿菌和釀酒酵母組成的耦合系統(tǒng)中,底物Ado被不可逆轉(zhuǎn)化為Hx,從而導(dǎo)致釀酒酵母缺乏可用來合成ATP的底物,這是耦合系統(tǒng)無法高效運(yùn)行的根本原因。作者通過基因工程的手段敲除了大腸桿菌中腺苷脫氨酶和腺嘌呤脫氨酶的基因,并且利用脯氨酸限制性培養(yǎng)來降低釀酒酵母中的腺嘌呤脫氨酶活性,從而大大降低了耦合系統(tǒng)中從Ado到Hx的不可逆轉(zhuǎn)化,進(jìn)而促使更多的底物Ado被用于再生A TP,最終耦合系統(tǒng)中A TP再生的效率大大提高,GSH合成量也相應(yīng)增加。

[1]Carmel-Harel O,Storz G.Roles of the glutathione-and thioredoxin-dependent reduction systems in theEscherichia coliandSaccharomyces cerevisiaeresponses to oxidative stress[J].Annual Review of Microbiology,2000,54:439-461.

[2]Pastore A,Federici G,Bertini E,et al.Analysis of glutathione:implication in redox and detoxification[J].Clinica Chimica Acta,2003,333(1):19-39.

[3]Li Y,Wei GY,Chen J.Glutathione:a review on biotechnological production[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2004,66(3):233-242.

[4]陳堅(jiān),衛(wèi)功元,李寅,等.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2004,23(5):104-110.

CHEN Jian,WEI Gong-yuan,LI Yin,et al.Progress in glutathione production by microbial fermentation[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2004,23(5):104-110.(in Chinese)

[5]Bloch K.The synthesis of glutathione in isolated liver[J].Journal of Biological Chemistry,1949,179(3):1245-1254. [6]Iwamoto S,Motomura K,Shinoda Y,et al.Use of anEscherichia colirecombinant producing thermostable polyphosphate kinase as an ATP regenerator to produce fructose 1,6-diphosphate[J].Applied and Environmental Microbiology, 2007,73(17):5676-5678.

[7]Murata K,Tani K,Kato J,et al.Glutathione production coupled with an ATP regeneration system[J].European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology,1980,10(1-2):11-21.

[8]Liao X Y,Deng T N,Zhu Y,et al.Enhancement of glutathione production by altering adenosine metabolism ofEscherichia coliin a coupled ATP regeneration system with Saccharomyces cerevisiae[J].Journal of Applied Microbiology, 2008,104(2):345-352.

[9]Lin J,Liao X Y,Du G C,et al.Enhancement of glutathione production in a coupled system of adenosine deaminase-deficient recombinantEscherichia coliandSaccharomyces cerevisiae[J].Enzyme and Microbial Technology,2009,44(5): 269-273.

[10]李寅,李華鐘,林金萍,等.生物合成谷胱甘肽種間耦合ATP再生系統(tǒng)的構(gòu)建[J].微生物學(xué)報(bào),2001,41(2):191-197. LI Yin,LI Hua-zhong,LIN Jin-ping,et al.Biosynthesis of glutathione:construction of ATP regeneration system betweenE.coliandS.cerevisiae[J].Acta Microbiologica Sinica,2001,41(2):191-197.(in Chinese)

[11]廖鮮艷,王蕓,朱至,等.面包酵母生物合成ATP的影響因素及機(jī)理初探[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2007,26(6):52 -57.

LIAO Xian-yan,WANG Yun,ZHU Zhi,et al.Factors and mechanism of ATP biosynthesis by the cells ofSaccharomyces cerevisiae[J].Journal of Food Science and Biotechnology,2007,26(6):52-57.(in Chinese)

[12]Liao X Y,Shen W,Chen J,et al.Improved glutathione production by gene expression inEscherichia coli[J].Letters in Applied Microbiology,2006,43(2):211-214.

[13]Baba T,Ara T,Hasegawa M,et al.Construction ofEscherichia coliK-12 in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection[J].Molecular Systems Biology,2006,2:8-9.

[14]Datsenko K A,Wanner B L.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coliK-12 using PCR products [J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000,97(12):6640-6645.

[15]Sherman F,Fink G R,Hicks J B.Methods in yeast genetics:laboratory manual[M].New York:Cold Spring Harbor, 1982.

[16]Tietze F.Enzymic method for quantitative determination of nanogram amounts of total and oxidized glutathione:application to mammalian blood and other tissues[J].Analytical Biochemistry,1969,27:502-522.

[17]Veciana-Nogues M T,Izquierdo-Pulido M,Vidal-Carou M C.Determination of ATP related compounds in fresh and canned tuna fish by HPLC[J].Food Chemistry,1997,59(3):467-472.

[18]Marmocchi F,Lupidi G,Venardi G,et al.Adenosine-deaminase fromSaccharomyces cerevisiaepurif icationand characterization[J].Biochemistry International,1987,14(3):569-580.

[19]Deeley M C.Adenine deaminase and adenine utilization inSaccharomyces cerevisiae[J].Journal of Bacteriology,1992, 174(10):3102-3110.

(責(zé)任編輯:李春麗)

Enhancement of Glutathione Synthesis by Improving ATP-Regenerating Efficiency in the Coupled System

LIN Jun1,2, LIAO Xian-yan＊1,2, DU Guo-cheng1,2, CHEN Jian1,2
(1.Key Lab of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Wuxi 214122,China;2.School of Biotechnology, Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A coupled system used for the biosynthesis of glutathione(GSH)was constructed withEscherichia coliΔadd/ade(pBV03)andSaccharomyces cerevisiaeWSH2.On one hand,the irreversible transformation from adenosine(Ado)to hypoxathine(Hx)inE.coliΔadd/ade(pBV03)was completely blocked by the disruption of adenosine deaminase(ADA)and adenine deaminase(ADE).On the other hand,the activity of ADE inS.cerevisiaeWSH2 decreased greatly when it was cultured in proline minimal medium.Therefore,the transformation from Ado into Hx decreased significantly,and more Ado was used to regenerate ATP byS.cerevisiaeWSH2.At last,ATP-regenerating efficiency was improved,and GSH production reached 13.68mmol/L,which was 5.14 fold of the control.

glutathione,biosynthesis,coupledsystem,Escherichia coli,S accharomyces cerevisiae

Q 493.8

:A

1673-1689(2010)02-0258-07

2009-04-21

國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z313);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30800008);江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2008096)。

林軍(1979-),男,山東榮成人,發(fā)酵工程博士研究生。

＊通信作者:廖鮮艷(1975-),女,湖南衡陽人,工學(xué)博士,副教授,主要從事發(fā)酵工程和生化工程方面的研究。Email:xyliao@jiangnan.edu.cn