張莉, 姜媛媛, 張健, 楊貞耐

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心,吉林長(zhǎng)春 130033)

牛凝乳酶全長(zhǎng)cDNA的克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建

張莉, 姜媛媛, 張健, 楊貞耐＊

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心,吉林長(zhǎng)春 130033)

從小牛皺胃中提取凝乳酶(Chymosin)總RNA,經(jīng)過(guò)RT-PCR獲得凝乳酶cDNA,純化后與pMD-18T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,通過(guò)雙酶切和序列測(cè)定,獲得了凝乳酶全長(zhǎng)基因序列。序列測(cè)定表明,凝乳酶全長(zhǎng)核苷酸長(zhǎng)度為1 143 bp,編碼381個(gè)氨基酸。與GenBank上已發(fā)表序列NM_180994進(jìn)行比較,核苷酸同源性為99.56%。將該基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET-22b中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b/Chymosin,所獲重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切、測(cè)序鑒定,證實(shí)含有目的片段,且連接、構(gòu)建正確,為凝乳酶的進(jìn)一步表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。

凝乳酶;克隆;原核表達(dá)載體;構(gòu)建

凝乳酶(Chymosin)是從未斷奶的小牛皺胃中提取的一種天冬氨酸蛋白酶,其主要的生物學(xué)功能是水解牛乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106鍵,導(dǎo)致牛乳凝結(jié),因此被廣泛用于干酪制造業(yè)。隨著世界范圍內(nèi)干酪產(chǎn)量的巨增及全球性小牛短缺,使得天然凝乳酶供應(yīng)不足,應(yīng)用基因工程技術(shù)可以使凝乳酶基因在微生物中高效表達(dá),從而為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)打下良好的基礎(chǔ)。

牛凝乳酶通常在小牛第四胃,即皺胃中合成為一個(gè)含有381個(gè)氨基酸的前體聚肽——凝乳酶原前體(Preprochymosin),凝乳酶原前體在分泌過(guò)程中去掉16個(gè)信號(hào)肽形成含有365個(gè)氨基酸的凝乳酶原(Prochymosin)。凝乳酶原沒(méi)有活性,它在酸性p H下通過(guò)多步的自動(dòng)催化過(guò)程,去掉N末端42個(gè)氨基酸形成有活性的含有323個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)——凝乳酶成熟肽(Chymosin)。在一定條件下,凝乳酶原可以通過(guò)去除N末端27個(gè)氨基酸形成另一種酶,假凝乳酶(Pesudochymosin)。凝乳酶和假凝乳酶都具有凝乳活性。凝乳酶蛋白結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 牛凝乳酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)Fig.1 Protein structure of bovine chymosin

牛凝乳酶的基因組DNA是由8個(gè)內(nèi)含子分開(kāi)的9個(gè)外顯子組成[2]。牛凝乳酶有3個(gè)主要的形態(tài):A,B和C,凝乳酶B的含量最高[3]。凝乳酶A和B只有1個(gè)氨基酸位置不同:凝乳酶A在243位(胃蛋白酶編碼)上是Asp,而凝乳酶B在這個(gè)位置是Gly。凝乳酶C是凝乳酶A降解后,去掉3個(gè)殘基Asp244-Phe246后的產(chǎn)物[4]。

作者根據(jù)GenBank上發(fā)表的凝乳酶B基因(NM_180994)設(shè)計(jì)引物,從小牛皺胃中提取凝乳酶總RNA,經(jīng)過(guò)RT-PCR獲得牛凝乳酶全長(zhǎng)cDNA,構(gòu)建原核表達(dá)載體,為凝乳酶的工業(yè)化制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

皺胃粘膜取自未斷奶的荷斯坦小牛第四胃,大腸桿菌JM109,表達(dá)載體pET-22b;作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性?xún)?nèi)切酶,DNA回收試劑盒,T4 DNA連接酶:購(gòu)于MBI,Trizol Reagent;RT-PCR試劑盒:購(gòu)于Invitrogen;pMD-18T,DL2000,DL15000,Ex-Taq,dNTP:購(gòu)于Ta KaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR擴(kuò)增儀:Eppendorf公司制造;高速冷凍離心機(jī):Thermo公司制造;超低溫冰箱:Thermo公司制造;電泳儀:Bio-rad公司制造;凝膠成像系統(tǒng):Alpha公司制造;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):Varian公司制造。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 應(yīng)用Primer(Version 5.0)基因分析軟件,參照GenBank發(fā)表的凝乳酶(NM_180994)基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,并且在上游引物中加入Nco I酶切位點(diǎn),下游引物中加入Xho I酶切位點(diǎn)。該對(duì)引物理論跨幅包括凝乳酶CDS序列1 143 bp,引物由上海生工公司合成。

1.3.2 凝乳酶總RNA的提取 無(wú)菌采取小牛皺胃,液氮保存。凝乳酶總RNA的提取按照Invitrogen Trizol的說(shuō)明書(shū),-70℃保存。取5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.3.3 RT-PCR體外擴(kuò)增目的基因片段

1)合成cDNA:取1μL提取的總RNA于滅菌的0.5 mL離心管中,置于冰上,再加入DEPC水8μL,1μL 50μmol/L Oligo(dT)20,于65℃水浴保溫5 min后立即置于冰上,加入5×cDNA Synthesis Buffer 4μL,0.1 mol/L DTT 1μL,1μL 40 U/μL RNase OU TTM,DEPC水1μL,15 U/μL Thermoscript RT 1μL,混勻后于50℃反應(yīng)60 min,之后于85℃反應(yīng)5 min終止反應(yīng)。加1μL RNase H,37℃、20 min去除RNA模板。取2μL進(jìn)行PCR反應(yīng),剩余物于-20℃貯存。

2)PCR反應(yīng):反應(yīng)體系為10×PCR Buffer Minus Mg 5μL,50 mmol/L MgCl21.5μL,10 mmol/L dNTP Mix 1μL,20μmol/L sense primer 0.5μL,20μmol/L antisense primer 0.5μL,5 U/μL Platium tag DNA polymerase 0.4μL,cDNA 2μL,DEPC-treated Water 39.1μL。

反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min,然后94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸90 s,72℃延伸10 min,30次循環(huán)。產(chǎn)物用0.8 g/dL瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 PCR產(chǎn)物TA克隆 將電泳回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接反應(yīng),16℃連接1 h后,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,在含有X-gal、IPTG和Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h,挑取白斑菌落接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)12～16 h。提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定。選擇酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海生工公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3.5 表達(dá)載體的構(gòu)建 將含有目的基因的質(zhì)粒和pET-22b同時(shí)用Nco I和Xho I酶切,分別回收后用T4 DNA連接酶連接,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b/Chymosin。再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,在含有Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h,挑取陽(yáng)性菌落,接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)12～16 h。按質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明提取重組質(zhì)粒,再進(jìn)行PCR及酶切電泳檢測(cè)鑒定。選擇酶切和PCR鑒定為重組陽(yáng)性的質(zhì)粒,送上海生工公司進(jìn)行序列測(cè)定,驗(yàn)證重組質(zhì)粒讀碼框的正確性。

2 結(jié) 果

2.1 凝乳酶總RNA鑒定

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA,28S、18S和5S條帶明亮、清晰,因此,提取的RNA可用于后續(xù)試驗(yàn),見(jiàn)圖2。

圖2 Chymosin總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.2 Agarose gel electrophoresis of total RNA of Chymosin

2.2 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

以提取的總RNA為模板,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3,擴(kuò)增的DNA片段與預(yù)期大小一致,約為1 200 kb。

2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的連接和篩選

用DNA回收試劑盒對(duì)凝乳酶cDNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收,然后與pMD-18T進(jìn)行TA連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。藍(lán)白篩選挑取白色菌落擴(kuò)培后,進(jìn)行堿變性法提取質(zhì)粒,用Nco I和Xho I雙酶切及PCR鑒定,選出陽(yáng)性克隆,命名為JM109/18T/Chymosin。

2.4 克隆質(zhì)粒測(cè)序

將上述陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送上海生工,進(jìn)行正反兩個(gè)防線(xiàn)的序列測(cè)定,報(bào)告的核苷酸序列為1 257 bp,除去兩端引物中的多余堿基,得到全長(zhǎng)為1 143 bp的核苷酸序列,含有一個(gè)完整的閱讀框,編碼381個(gè)氨基酸,見(jiàn)圖4。此序列已經(jīng)提交到GenBank,收錄號(hào)為FJ768675。與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中凝乳酶基因NM_180994序列進(jìn)行比對(duì)分析,核苷酸同源性為99.56%。結(jié)果顯示有5個(gè)堿基變異,第44 bp (以ATG為1計(jì))由A→G,第431 bp由A→G,第687 bp由A→G,第816 bp由T→C,第1 007 bp由A→G,其編碼的氨基酸序列中有1個(gè)不一致,第229位氨基酸由N(Asn)→D(Asp)(見(jiàn)粗體下劃線(xiàn))。

2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將18T/Chymosin及表達(dá)載體pET-22b經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切后,純化回收后構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化JM109后挑選白色菌落,提取質(zhì)粒后酶切及PCR擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定在約1 200 bp處有特異條帶,經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切后電泳出現(xiàn)兩條帶,其中一條為載體質(zhì)粒,約5 500 bp,另一條帶為所克隆的Chymosin基因片段,約1 200 bp,見(jiàn)圖5。測(cè)序結(jié)果表明,該轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒中確實(shí)含有目的基因片段,且讀碼框正確,重組質(zhì)粒pET-22b/ Chymosin構(gòu)建成功。

圖4 重組凝乳酶的核苷酸序列及其編碼的氨基酸Fig.4 The nucleotide sequence and deduced amino acids of recombinant chymosin

圖5 重組表達(dá)質(zhì)粒PCR和酶切鑒定圖Fig.5 Identification of recombinant plasmid by digested (Nco I+Xho I)and PCR

3 結(jié) 語(yǔ)

作者所研究的凝乳酶B基因,經(jīng)過(guò)比對(duì),發(fā)現(xiàn)克隆的凝乳酶基因與GenBank上NM_180994核苷酸序列有5個(gè)堿基變異,但其中有4個(gè)變異的堿基并不影響編碼的氨基酸,所以氨基酸序列只有229位的Asn(N)突變?yōu)锳sp(D)。

通過(guò)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),本研究得到的凝乳酶氨基酸序列與目的序列NM_180994相差一個(gè)氨基酸(箭頭指示處),但是與Protein Data Bank上登錄的凝乳酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)4CMS的氨基酸序列完全一致[5],見(jiàn)圖6。通過(guò)進(jìn)一步分析GenBank上登錄的凝乳酶A和C的氨基酸序列[6-7],根據(jù)Danley等人(1988)對(duì)凝乳酶的描述,凝乳酶A,B和C在此位點(diǎn)的氨基酸序列應(yīng)該是一致的。進(jìn)而與另外兩種反芻動(dòng)物,綿羊[8]及駱駝[9]的凝乳酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)其第229位上的氨基酸序列與本研究所得到的氨基酸序列一致,所以不能確定此位點(diǎn)是否為突變,有可能是GenBank上登錄的NM_ 180994序列有誤。通過(guò)以上分析可以判斷,不論此位點(diǎn)是否為突變,對(duì)凝乳酶的功能沒(méi)有影響,克隆的凝乳酶基因可用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

圖6 氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.6 Alignment of the peptide sequences

凝乳酶作為乳凝固用酶廣泛應(yīng)用于干酪的工業(yè)化生產(chǎn)。我國(guó)干酪生產(chǎn)所用凝乳酶主要依賴(lài)于進(jìn)口,利用生物工程技術(shù)生產(chǎn)凝乳酶,可以減少對(duì)進(jìn)口產(chǎn)品的依賴(lài),降低干酪生產(chǎn)成本,促進(jìn)我國(guó)干酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

pET系統(tǒng)是在E.coli中克隆表達(dá)重組蛋白的首選,pET系列載體是利用大腸桿菌T7噬菌體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的載體。將凝乳酶基因片段克隆到原核表達(dá)載體pET-22b中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-22b/Chymosin,所獲重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切、測(cè)序鑒定,證實(shí)含有目的基因片段,且連接、構(gòu)建正確,為凝乳酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯:李春麗)

Cloning and Prokaryotic Expression Vector Construction of Bovine Chymosin

ZHANG Li, J IANG Yuan-yuan, ZHANGJian, YANG Zhen-nai＊
(Center of Agro-Food Technology,Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun,130033,China)

In this study,the total RNA of chymosin was extracted from absomum of calf and its cDNA was obtained by RT-PCR.The purified RT-PCR products and pMD-18T vector were ligated and transformed into host strainE.coliJM109.The full length of Chymosin gene is consist of 1 143 bp,and encodes 381 amino acids.The homology of the nucleotides with NM_ 180994 is 99.56%.The aim gene was expression on the prokaryotic expression vector pET-22b and a recombinant plasmid pET-22b/Chymosin was constructed successfully.

chymosin,cloning,prokaryotic expression vector,construction

Q 785

:A

1673-1689(2010)02-0271-05

2009-02-27

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2006AA10Z306);吉林省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(20060219、20080228);現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目。

＊通信作者:楊貞耐(1965-),男,江西廣豐人,博士,研究員,主要從事乳品工藝及生物技術(shù)方面的研究。Email: zyang@cjaas.com