田曉艷, 劉延吉, 祝懷宇, 朱顯靜

(1.遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,遼寧撫順 113001;2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧沈陽 110161)

沙棘多糖HRP Ia生物活性初探

田曉艷1, 劉延吉＊2, 祝懷宇2, 朱顯靜1

(1.遼寧石油化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院,遼寧撫順 113001;2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧沈陽 110161)

研究了沙棘多糖(Hippophae rhamnoidesL.polysaccharide,HRP)保健功能及其抑菌作用。分別對HRP、HRP I、HRP Ia進(jìn)行自由基·OH、O·-2、R·清除、抑菌效果及最小抑菌濃度的測定。HRP Ia對·OH、O·-2及R·清除率最高,清除·OH、O·-2及R·所需最大質(zhì)量濃度分別為:1 000、400、80μg/mL;HRP Ia對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌等菌種均有一定的抑制作用。

沙棘多糖;多糖;自由基;抑菌作用;生物活性

沙棘(Hippophae rhamnoidesL)為胡頹子科植物,是防風(fēng)固沙的理想材料。沙棘果實(shí)中的活性成分已達(dá)到190多種,油中的活性成分有106種,其中脂溶性維生素有6種,脂肪酸22種,脂類42種,黃酮和酚類36種。沙棘黃酮具有抗心肌缺氧缺血、抗心率失常、提高耐缺氧能力、降血脂、清膽固醇、抑制血小板聚集、抗?jié)儭⒖鼓[瘤、抗炎、抗過敏、抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗菌、抗病毒以及增強(qiáng)免疫力等功效。沙棘多糖(HRP)有較強(qiáng)的抗氧化作用,還對引起病毒性心肌炎的病毒具有明顯的抑制作用。華東師大黃曉青等采用沙棘果榨汁提油后的果渣及籽渣提取的2種沙棘多糖為材料,通過研究沙棘多糖對小鼠實(shí)驗(yàn)性高脂血癥的影響,觀察其降血脂作用,證明沙棘多糖具有降低血清LDLC,降低肝臟TC和高脂飲食引起的血糖升高,降低SGOT活性,保持肝臟功能。目前對多糖生物學(xué)功效的研究愈來愈引起國內(nèi)外藥理學(xué)家、生物學(xué)家和化學(xué)家們的興趣,它已成為當(dāng)代生物學(xué)的熱門領(lǐng)域[1-4]。作者對沙棘多糖進(jìn)行體外清除自由基活性及其抑菌作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

沙棘多糖:由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自行制備;細(xì)菌:大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌;真菌:番茄煤霉、棉花紅腐、黑曲霉由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 清除·OH的測定 參考Fenton反應(yīng)體系,體系中加入水楊酸,則產(chǎn)生有色產(chǎn)物,并在波長510 nm處有強(qiáng)吸收;若反應(yīng)體系加入具有清除· OH功能物質(zhì),則與水楊酸競爭·OH,使有色產(chǎn)物生成量減少[5]。清除率E(%)=[A0(對照)-A510 (樣品)]/A0(對照)×100%。

1.2.2 清除O·-2的測定 鄰苯三酚在堿性條件下能迅速自氧化,產(chǎn)生超氧陰離子自由基(Superoxidea nionf reer adical,SAFR),此SAFR繼續(xù)加速其自氧化反應(yīng)。若及時清除SAFR,就會抑制其自氧化反應(yīng)速率,借此觀察沙棘水溶性多糖對SAFR的影響[6]。

1)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物吸收曲線的制備:對3 mmol/L鄰苯三酚在p H 8.2,0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液中的自氧化產(chǎn)物進(jìn)行掃描(掃描范圍280～600 nm),確定測試波長。取2.8 mL的Tris-HC1 (p H 8.2)緩沖液,2 mL蒸餾水,混勻后在25℃水浴中保溫20 min,取出后立即加入在25℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚0.2 mL,空白管為10 mmol/L HCl,迅速搖勻后倒入比色杯,325 nm下每隔30 s測定吸光度,計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加ΔA0,即鄰苯三酚的自氧化速率。自氧化速率為ΔA0/Δt=0.006/min。

2)沙棘多糖清除O·-2的測定:按上述方法操作,在加入鄰苯三酚前,先加入一定體積的多糖溶液,蒸餾水減少相應(yīng)體積。清除率E(%)=(ΔA0/ Δt-ΔA/Δt)/(ΔA0/Δt)×100%。ΔA0為鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)速率,ΔA為加入多糖溶液后鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)速率。

1.2.3 清除R·的測定 濃乙醇在堿性有氧環(huán)境、強(qiáng)紫外線下光解產(chǎn)生CH3CHOH2,CH3C作為自由基引發(fā)劑,直接作用于大豆植物油分中的多不飽和脂肪酸形成R,經(jīng)共軛和氧化形成脂過氧自由基(ROO·),再分解為丙二醛(MDA),它可以與硫代巴比妥酸(TBA)發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生紅色物質(zhì)。產(chǎn)生的反應(yīng)體系含乙醇體積分?jǐn)?shù)95%、大豆油體積分?jǐn)?shù)0.01%,0.1 mol/L FeSO4-EDTA,0.1 mol/L磷酸緩沖液(p H 8.0)及不同質(zhì)量濃度的多糖,紫外光照射60 min。再加20%三氯醋酸1 mL,混勻,加0.67%TBA 1.5 mL,沸水浴10 min,532 nm測定吸光度,清除率(E%)=(A0-A樣品)/A0× 100%[6]。

1.2.4 抑菌效果的測定 將沙棘粗多糖HRP及HRP Ia分別配制成質(zhì)量濃度為200μg/mL的飽和多糖溶液備用。將已滅菌的濾紙片置于滅菌的沙棘多糖HRP及HRP Ia溶液中,浸泡30 min,無菌生理鹽水作對照。制作菌平板,4次重復(fù)。同一培養(yǎng)皿中,生理鹽水浸泡1片濾紙片作為對照,多糖液浸泡2～3片濾紙片。細(xì)菌培養(yǎng)24 h,觀察其抑菌效果并測定抑菌圈的直徑。真菌培養(yǎng)48 h,觀察其抑菌效果并測定抑菌圈的直徑。

1.2.5 最小抑菌濃度(MIC)的測定 將HRP及HRPⅠa配制成質(zhì)量濃度為6.25～200μg/mL系列溶液。取不同質(zhì)量濃度的多糖液各1.0 mL,再取各菌懸液0.2 mL,倒入60℃左右的固體培養(yǎng)基中充分混勻,冷卻凝固后倒置恒溫培養(yǎng),2次重復(fù),不長菌的最低質(zhì)量濃度為最小抑制質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘多糖對·OH的清除

由圖1可以看出,在200～1 000μg/mL的范圍內(nèi),HRP、HRP I、HRP Ia對·OH清除率隨多糖質(zhì)量濃度增加而增大,且最大清除率為HRP Ia(71.1%)>HRP I(66.9%)>HRP(10.3%),推測HRP Ia是清除·OH的主要活性物質(zhì)。

圖1 沙棘多糖對·OH的清除Fig.1 Scavenging effect of HRP,HRP I,HRP Ia on ·OH

2.2 清除O·-2的測定

鄰苯三酚的自氧化曲線見圖2,線性關(guān)系為y=0.005 8x+0.34,所以取ΔA0/Δt=0.006/min。

圖2 鄰苯三酚自氧化曲線Fig.2 Self-oxidation of Pyrogallol

由圖3可知,在80～400μg/mL的質(zhì)量濃度范圍之內(nèi),HRP、HRP I、HRP Ia對O·-2的清除率隨多糖質(zhì)量濃度增加而增大。但在400～480μg/mL區(qū)域內(nèi),HRP I、HRP Ia的清除率均有所下降,推測是由于多糖的質(zhì)量濃度過高產(chǎn)生了助氧化作用,從而使清除率下降。最大清除率分別為HRP Ia (55%)>HRP I(51.2%)>HRP(33.3%),推斷HRP Ia是清除O·-2的主要活性物質(zhì)。

圖3 沙棘多糖對O·-2的清除Fig.3 Scavenging effect of HRP,HRP I,HRP Ia on O·-2

2.3 沙棘多糖清除R·的測定

由圖4可知,在80～480μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),HRP、HRP I、HRP Ia對R·的清除率隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而減小。這可能是由于在自由基引發(fā)劑存在的條件下,多糖也可能自動氧化,產(chǎn)生新的有機(jī)自由基,高質(zhì)量濃度多糖清除的自由基數(shù)目可能少于其自身產(chǎn)生自由基的數(shù)目;但低質(zhì)量濃度的多糖溶液中,可能是減少了多糖分子與自由基引發(fā)劑的反應(yīng)幾率,從而表現(xiàn)出多糖的抗氧化作用。沙棘多糖對R·的清除率遠(yuǎn)小于對·OH、O·-2的清除作用,最大清除率分別為:HRP Ia (30.05%)>HRP I(25.38%)>HRP(2.14%),再次推斷HRP Ia是清除R·的主要活性物質(zhì)。

圖4 沙棘多糖對R·清除Fig.4 Scavenging effect of HRP,HRP I,HRP Ia on R·

2.4 沙棘多糖抑菌作用

沙棘多糖的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,沙棘多糖HRP Ia對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌、番茄煤霉、棉花紅腐等菌種均有一定的抑制作用。沙棘多糖HRP僅對于大腸桿菌、臘狀芽孢桿菌有一定抑制作用,對于真菌無抑制作用。但沙棘多糖對蘇云金芽孢桿菌、黑曲霉均無抑制作用,見表1,2。

表1 沙棘多糖對細(xì)菌的抑菌圈大小Tab.1 Size of antimicrobial circle of HRP and HRP Ia to bacterium單位:mm

表2 沙棘多糖對真菌的抑菌圈大小Tab.2 Size of antimicrobial circle of HRP and HRP Ia to fungus單位:mm

2.5 最小抑菌濃度(MIC)的測定

1)HRP最小抑菌濃度(MIC):MIC臘紙狀芽胞桿菌為25μg/mL;MIC大腸桿菌為50μg/mL。

2)HRP Ia最小抑菌濃度(MIC):MIC大腸桿菌為25μg/mL;MIC臘紙狀芽胞桿菌為12.5μg/ mL;MIC枯草桿菌為12.5μg/mL;MIC番茄煤霉為50μg/mL;MIC棉花紅腐為200μg/mL。

3 討 論

沙棘多糖HRP、HRP I和HRP Ia具有清除· OH、O·-2及R·的功能,并且清除率分別為HRP Ia>HRP I>HRP。因?yàn)镠RP是粗多糖,進(jìn)一步提取后得HRP I,再純化得HRP Ia,前期提取實(shí)驗(yàn)各組分得率分別為:HRP 10.17%、HRP 18.95%、HRP Ia 3.2%;HRP的得率是HRP Ia得率的3.18倍[7],而HRP Ia清除自由基的能力是HRP的1.65～14.04倍。說明精多糖HRP Ia是主要活性物質(zhì),而粗多糖HRP及HRP I中其他雜質(zhì)的活性低。精多糖HRP Ia主要由木糖、甘露糖、葡萄糖組成,這些單糖都含有還原性半縮醛基,這可能與多糖的抗氧化活性有關(guān)。沙棘多糖HRP Ia的抑菌效果再一次證明了HRP Ia是沙棘多糖中主要活性物質(zhì)。

1)沙棘多糖具有清除·OH、O·-2及R·的功能,并且清除率HRP Ia>HRP I>HRP。HRP Ia清除·OH、O·-2及R·所需最大質(zhì)量濃度分別為:1 000、400、80μg/mL。

2)沙棘多糖HRP Ia對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌、番茄煤霉、棉花紅腐等菌種均有一定的抑制作用;沙棘多糖HRP僅對于大腸桿菌、臘狀芽孢桿菌有一定抑制作用,對于真菌無抑制作用。HRP最小抑菌濃度(MIC):臘狀芽胞桿菌25μg/mL;大腸桿菌50μg/mL。HRP Ia最小抑菌濃度(MIC):大腸桿菌25μg/mL;臘狀芽胞桿菌12.5μg/mL;枯草桿菌12.5μg/mL;番茄煤霉50μg/ mL;棉花紅腐200μg/mL。

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(責(zé)任編輯:李春麗)

Determination of Polysaccharide HRP Ia Biological Activity from Hippophae rhamnoidesL.

TIAN Xiao-yan1, LIU Yan-ji＊2, ZHU Huai-yu2, ZHU Xian-jing1
(1.Environmental Technology and Biotechnology College,Liaoning University of Petroleum&Chemical Technology,Fushun 113001,China;2.Biotechnology College,Shenyang Agriculture University,Shenyang 110161,China)

This manuscript was to study the health function and bacteriostasis ofHRP fromHippophae rhamnoidesL.Through determining the scavenging capacity of·OH,O·-2,R, and bacteriostasis and minimal inhibitory concentration by HRP,HRP I and HRP Ia,it has been found proven that HRP Ia exhibit highest scavenging capacity on on·OH,O·-2and R·,The maximum concentration for cleaning these free radical is 1000,400,80μg/mL,respectively. Furthermore,HRP Ia can also inhibit the growth of E.coli,Bacillus subtilis,Bacillus cereus, and so on.

Hippophae rhamnoidesL,polysaccharide,free radical,bacteriostasis,biological activity

TS 241

:A

1673-1689(2010)02-0294-04

2009-05-25

國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2004AA247010)

田曉艷(1971-),女,遼寧沈陽人,農(nóng)學(xué)碩士,講師,主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。Email:maggietian2002@163.com

＊通信作者:劉延吉(1959-),男,遼寧大連人,農(nóng)學(xué)博士,副教授,主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。Email: yanjiliu@yahoo.com.cn