王洪鵬 葉 琳 王 馳 陳鴻雁△

1 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（重慶 400016）

2 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（重慶 400016）

茶多酚和粉防己堿聯(lián)合抗腫瘤藥物對(duì)鼻咽癌耐藥細(xì)胞株HNE-1（200）增殖的抑制作用*

王洪鵬1葉 琳1王 馳2陳鴻雁1△

目的研究天然有效成分茶多酚（TP）和粉防己堿（TET）分別聯(lián)合4種常見(jiàn)抗腫瘤藥物對(duì)鼻咽癌耐藥細(xì)胞株HNE-1（200）增殖的抑制作用。方法以鼻咽癌耐藥細(xì)胞株HNE-1（200）為研究對(duì)象，用MTT法測(cè)定無(wú)毒劑量的TP和TET分別聯(lián)合順鉑（DDP）、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、長(zhǎng)春新堿（VCR）、阿霉素（ADM）對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的增殖抑制率。結(jié)果無(wú)毒劑量的TP分別與4種抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用后，藥物對(duì)HNE-1（200）細(xì)胞的抑制率增加約200%;無(wú)毒劑量的TET分別與4種抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用后，藥物對(duì)HNE-1（200）細(xì)胞的抑制率增加約300%。結(jié)論無(wú)毒濃度的天然藥物TP、TET分別與抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用能提高藥物對(duì)鼻咽癌耐藥細(xì)胞株的增殖抑制率，降低藥物的IC50。

茶多酚 粉防己堿 鼻咽癌 HNE-1（200）細(xì)胞系 多藥耐藥

1 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（重慶 400016）

2 重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（重慶 400016）

*重慶市衛(wèi)生局資助課題（No.2006-B-16）

△通訊作者

鼻咽癌我國(guó)南方常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，化療是臨床治療鼻咽癌晚期的主要方法之一，而多重耐藥（MDR）的產(chǎn)生導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性下降，嚴(yán)重影響了化療的效果。大部分化療藥物和化療增敏劑具有較大的毒副作用，未能廣泛應(yīng)用[1，2]。近年來(lái)，從天然藥物中篩選出高效、低毒性的化療增敏劑已成為研究熱點(diǎn)。本研究選用天然有效成分茶多酚（TP）和粉防己堿（TET）檢測(cè)其分別和4種常見(jiàn)抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)鼻咽癌耐藥細(xì)胞株的增殖抑制作用，為天然藥物在頭頸腫瘤化療中的應(yīng)用提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞系和培養(yǎng)條件：鼻咽癌耐藥細(xì)胞株HNE-1（200）細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院王馳副教授提供，由人鼻咽癌細(xì)胞HNE-1經(jīng)放射線誘導(dǎo)而來(lái)。細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃ 5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。（2）試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBlo，美國(guó)）;新生牛血清（購(gòu)自杭州四季青生物工程材料研究所）;粉防己堿（重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院王馳副教授惠贈(zèng)）;四甲基偶氮唑鹽（MTT，購(gòu)自北方同正生物制品公司）;DDP、5-Fu、VCR、ADM均為國(guó)產(chǎn);TP為黃褐色粉末（含量60%，Sigma公司產(chǎn)品）。（3）儀器和設(shè)備：二氧化碳孵箱（美國(guó)LRBODEL）;超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）;XSZ-D2倒置顯微鏡 （重慶光學(xué)儀器廠）;Model 450型酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD酶標(biāo)儀）;Varian 600C型直線加速器 （美國(guó)）;光學(xué)顯微鏡（Olympus）。

1.2 方法 （1）MTT法測(cè)定抗腫瘤藥物抑制HNE-1（200）耐藥細(xì)胞株生長(zhǎng)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HNE-1（200）耐藥細(xì)胞稀釋至（1.5～2）×105/mL，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)1d，加藥，繼續(xù)培養(yǎng)4d，棄去培養(yǎng)液，每孔加0.5mg/mL的MTT 20μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，待溶解后用BIO-RAD Model 450型酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)吸光度值A(chǔ)570，并計(jì)算腫瘤細(xì)胞存活率，從而預(yù)測(cè)抗腫瘤藥物對(duì)某種腫瘤細(xì)胞的抑制作用。腫瘤細(xì)胞抑制率（fa%）=[1-實(shí)驗(yàn)孔A570/對(duì)照孔A570]×100% 。（2）MTT法測(cè)定單獨(dú)應(yīng)用DDP、5-Fu、VCR、ADM對(duì)HNE-1（200）耐藥細(xì)胞株的增殖抑制作用：處理組中加入不同濃度的DDP、5-Fu、VCR及ADM，對(duì)照組除不含抗腫瘤藥物外其他條件完全一致。分組方法及濃度如下：DDP處理組設(shè)置A（0.25μg/mL）、B（0.5μg/mL）、C（1.0μg/mL）、D（1.5μg/mL）、E（3.0μg/mL）5個(gè)質(zhì)量濃度水平。5-FU處理組設(shè)置 A（3.125μg/mL）、B（6.25μg/mL）、C（12.5μg/mL）、D（25.0μg/mL）、E（50.0μg/mL）5個(gè)質(zhì)量濃度水平。ADM處理組設(shè)置A（1.25μg/mL）、B（2.5μg/mL）、C（5.0μg/mL）、D（10.0μg/mL）、E（20.0μg/mL）5個(gè)質(zhì)量濃度水平。VCR處理組設(shè)置A（2.5μg/mL）、B（5.0μg/mL）、C（10.0μg/mL）、D（20.0μg/mL）、E（40.0μg/mL）5個(gè)質(zhì)量濃度水平。（3）MTT法測(cè)定無(wú)毒劑量的TP、TET分別與4種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HNE-1（200）耐藥細(xì)胞株的抑制作用：TP、TET對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株無(wú)毒濃度篩選（方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[3]）。MTT法測(cè)定無(wú)毒劑量的TP、TET分別與4種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HNE-1（200）耐藥細(xì)胞株的抑制作用：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別加入對(duì)細(xì)胞無(wú)直接損害作用的TP、TET濃度，與不同質(zhì)量濃度的抗腫瘤藥物聯(lián)合使用（抗腫瘤藥物的質(zhì)量濃度不變），測(cè)定其HNE-1（200）耐藥細(xì)胞株的增殖抑制率（方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[3]）根據(jù)線性方程計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（IC50）值。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件。采用單因素方差分析，回歸方程的建立采用直線回歸法。

2 結(jié)果

2.1 單獨(dú)應(yīng)用DDP、5-Fu、VCR、ADM對(duì)HNE-1（200）耐藥細(xì)胞株的增殖抑制作用 見(jiàn)表1。單獨(dú)應(yīng)用DDP、5-Fu、VCR、ADM對(duì)HNE-1（200）耐藥細(xì)胞株的增殖抑制作用呈較明顯劑量依賴關(guān)系（P＜0.05），細(xì)胞抑制率為6% ～65%。

表1 不同抗腫瘤藥物對(duì)HNE-1（200）耐藥細(xì)胞株的抑制作用 （%）

2.2 TP、TET對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株的無(wú)毒劑量篩選 見(jiàn)圖1。經(jīng)過(guò)MTT法測(cè)定，回歸分析得出TP、TET對(duì)細(xì)胞抑制率小于10%時(shí)的藥物質(zhì)量濃度分別為0.15mg/mL、1.5μg/mL。以此質(zhì)量濃度藥物分別與HNE-1（200）細(xì)胞共同孵育，測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，加藥組的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線相近似（P＞0.05）。表明在此質(zhì)量濃度下，TP、TET對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。

圖1 TP、TET無(wú)毒劑量篩選結(jié)果

2.3 MTT法測(cè)定無(wú)毒濃度的TP、TET分別與4種化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HNE-1（200）耐藥細(xì)胞株的抑制作用 見(jiàn)圖2～圖5、表2。TP分別與DDP、5-Fu、VCR、ADM聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HNE-1（200）細(xì)胞的抑制率提高到19.01% ～79.66%，抑制率是單用抗腫瘤藥物的120% ～300%;TET分別與DDP、5-Fu、VCR、ADM聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HNE-1（200）細(xì)胞的抑制率提高至29.95%～81.96%，為單用抗腫瘤的126% ～400%。并且抗腫瘤藥物濃度越小，兩種天然成分的增效作用越強(qiáng)（P＜0.05），為進(jìn)一步了解各組增殖抑制率，采用直線回歸計(jì)算各組IC50值。從表2中可見(jiàn)聯(lián)合用藥組IC50均小于單用化療藥物（P＜0.05）。

圖2 幾種藥物與順鉑相互作用對(duì)HNE-1（200）細(xì)胞抑制作用的影響

圖3 幾種藥物與5-Fu相互作用對(duì)HNE-1（200）細(xì)胞抑制作用的影響

圖4 幾種藥物與長(zhǎng)春新堿相互作用對(duì)HNE-1（200）細(xì)胞抑制作用的影響

圖5 幾種藥物與阿霉素相互作用對(duì)HNE-1（200）細(xì)胞抑制作用的影響

3 討論

MDR是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生抗藥性的同時(shí)，對(duì)其它結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉抗藥性，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，如何逆轉(zhuǎn)MDR，提高藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，是目前研究的一大難點(diǎn)。研究表明，聯(lián)合用藥是臨床治療惡性腫瘤的常用方法之一，化療藥物與化療藥物聯(lián)合作用效果好，但由于毒副作用較大限制了其廣泛應(yīng)用[3，4]。天然藥物具有不良反應(yīng)少、毒性低的特點(diǎn)，在我國(guó)及其它亞洲國(guó)家廣泛應(yīng)用[5]，成為目前研究的熱點(diǎn)。

表2 各實(shí)驗(yàn)組抑制HNE-1（200）細(xì)胞的IC50變化

TP是組成復(fù)雜的茶葉提取物，具有化療增敏作用，冉鐵成等[6]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察TP的劑量-效應(yīng)關(guān)系，從而確證了茶多酚確有化療增敏作用。但目前對(duì)TP的研究在頭頸腫瘤較少見(jiàn)。

TET是是防己科植物粉防己的主要活性成分。資料表明粉防己堿具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在腫瘤防治等方面具有很好的應(yīng)用前景。研究表明，粉防己堿能明顯增強(qiáng)柔紅霉素和長(zhǎng)春新堿殺傷白血病細(xì)胞的能力，1.0×10-6mol/L的TET增加化療藥物DNR、VCR殺白血病細(xì)胞的作用為30%左右，并隨著藥物濃度的升高，促殺傷效應(yīng)逐漸增強(qiáng)[7，8]。但是粉防己堿對(duì)鼻咽癌耐藥細(xì)胞株作用報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)以采用MTT法檢測(cè)了不同質(zhì)量濃度的4種抗腫瘤藥物DDP、5-Fu、VCR、ADM單用和分別聯(lián)合無(wú)毒劑量的TP、TET對(duì)鼻咽癌耐藥細(xì)胞HNE-1（200）的增殖抑制作用，試圖發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用藥和聯(lián)合兩種天然化療增敏劑對(duì)鼻咽癌耐藥細(xì)胞株的作用特點(diǎn)。結(jié)果顯示，單用化療藥物，細(xì)胞抑制率在6%～65%之間，抑制作用呈劑量依賴關(guān)系;化療藥物聯(lián)合應(yīng)用無(wú)毒劑量的TP后，細(xì)胞抑制率提高到11% ～79%，約為單獨(dú)用藥的122%，聯(lián)合用藥IC50下降至單獨(dú)用藥的1/2左右;化療藥物聯(lián)合應(yīng)用無(wú)毒劑量的TET后，細(xì)胞抑制率提高到20%～85%,為單獨(dú)用藥的約131%，聯(lián)合用藥IC50下降至單獨(dú)用藥的1/2～1/3左右。單抗腫瘤藥物質(zhì)量濃度越小時(shí)，聯(lián)合兩種天然有效成分的化療增敏作用越明顯，提示較小劑量的抗腫瘤藥物聯(lián)合天然成分具有較明顯的減毒增效作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步顯示天然有效成分TP和TET在體外對(duì)鼻咽癌耐藥細(xì)胞具有較好的化療增敏作用，提示臨床鼻咽癌晚期化療可采用抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用一種或多種天然有效成分以提高治療效果，這對(duì)提高晚期鼻咽癌患者5年生存率及其生活質(zhì)量都具有一定的意義，同時(shí)也為T(mén)P和TET作為化療增敏劑的進(jìn)一步研究和應(yīng)用，提供了試驗(yàn)室依據(jù)。

[1]Fu LW，Deng ZA，Pan QC.et al.Screening and discovery of novel MDR modifiers from anturally occurring bisbenzylisoquinoline alkaloids[J].Anticancer Res，2001，21（4A）：2273 ～ 2280.

[2]Choi SU，Park SH，Kim KH，et al.The bisbenzylisoquinolineal alkaloids tetrandine and fan gchinoline，ehance the cytotoxicity of multidrug resistance related drugs,Aamodulation of P-glycoprotein[J].Anticancer Drugs，1998，9（3）：255.

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[4]Donna M，Bradshaw，Robert J，et al.Clinical relevance of transmembrane drug as a mechanism of multidrug resistance [J].Journal of Clinical Oncology，1998,16（11）：3674.

[5]王天曉，張鳳春，楊曉虹.敏藥堿-G逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的作用和機(jī)制研究[J].中國(guó)藥理報(bào),2005，21（5）：184～186.

[6]冉鐵城，王毅，劉新起，等.茶多酚主要成分對(duì)腫瘤多藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用[J].核化學(xué)與放射化學(xué)，2003，25（2）：74～80.

[7]許文林，敖忠芳，陳玉心，等.漢防己甲素對(duì)柔紅霉素和長(zhǎng)春新堿增效作用的實(shí)驗(yàn)研究 [J].中華血液學(xué)雜志，1994，15（5）：256～257.

[8]許文林，敖忠芳，陳寶安，等.漢防己甲素逆轉(zhuǎn)血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的臨床研究[J].中華內(nèi)科雜志，2001，40（9）：631～633.

Study of the Inhibitive Effects of Tea Polyphenols and Tetrandrine Combined with Antineoplastic Drugs on the HNE-1（200）Cell Line

WANG Hong-peng1,YE Lin1,WANG Chi2,et al
1 The First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University（Chongqing 400016）
2 Chongqing Medical University（Chongqing 400016）

Objective:To obverse the inhibitive effects of tea polyphenols and tetrandrine apiece combined with 4 kinds of antineoplastic drugs on the HNE-1 （200）cell line.Methods:MTT method was used to determine the inhibitory proliferation effects of non-toxic dose tea polyphenols and tetrandrine apiece combined with DDP,5-Fu,VCR and ADM on HNE-1（200）cell line.Results:Non-toxic dose tea polyphenols combined with 4 kinds of antineoplastic drugs could increase the inhibitory rate to 200%.Non-toxic dose tetrandrine could increase it to 300%.Conclusion:Non-toxic dose tea polyphenols and tetrandrine apiece combined with antineoplastic drugs can increase the inhibitory rate of it on HNE-1（200）cell line and decline IC50of antineoplastic drugs.

Tea polyphenols;Tetrandrine;Nasopharyngeal carcinoma;HNE-1（200）cell line;Multidrug resistance

R285.5

A

1004-745X（2010）01-0102-03

2009-08-09）