何 峻,周從容,周 樺

(1.貴州省人民醫(yī)院婦科生殖中心;2.貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖中心,貴陽550004)

自從1975年卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)被應用于不孕婦女的超促排卵(controlled ovarian stimulation,COS)治療以來,FSH一直是體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)治療時COS的首選藥物,適量的FSH是獲得多個成熟卵泡并最終實現(xiàn)胚胎移植成功的基礎。如何預測卵巢的反應性,以正確使用FSH的劑量是人們一直非常關注的問題。臨床常用的檢測方法有很多,如年齡、基礎FSH水平、竇卵泡數(shù)等,都不能很好地預測患者對FSH刺激的反應性。由于FSH在卵子成熟過程中的重要作用,FSH受體(FSH receptor,FSHR)作為FSH在體內(nèi)發(fā)揮作用的最主要的途徑,已經(jīng)越來越受到關注。理論上FSHR基因的多態(tài)性可引起FSHR空間結構發(fā)生變化,從而影響FSHR與其配體相互作用的過程,引起相關受體信息傳遞的變化,影響卵巢對FSH刺激的反應,所以有學者認為FSHR基因多態(tài)性可能與卵巢對FSH的反應性有關[1]。

目前大家對FSHR基因外顯子10上680位的單苷酸多態(tài)性(SNP)非常關注,但大家的看法并不一致[2-4]。目前國內(nèi)外沒有全面的對不同人種的多態(tài)性分布進行比較的報道。因此,本文擬探討FSHR基因外顯子10上680位的SNP與卵巢反應的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2007年4月至2010年1月在貴陽醫(yī)學院生殖醫(yī)學中心就診的不孕患者120例,均使用常規(guī)注射用醋酸曲普瑞林(達菲林,博福-益普生(天津)制藥有限公司生產(chǎn))長方案降調(diào)及注射用重組人促卵泡素(果納芬,瑞士默克雪蘭諾公司生產(chǎn))進行COS治療。入選標準:①不孕原因為輸卵管及(或)男方因素、不明原因者,均無內(nèi)分泌疾病史或卵巢手術史;②基礎性激素FSH＜10 U·L-1;③年齡≤35歲,就診前3個月無促排卵及類固醇激素使用史;④B超檢查無多囊卵巢征象者;⑤既往月經(jīng)周期規(guī)律,經(jīng)量正常者。

卵巢反應分級根據(jù)《現(xiàn)代輔助生育技術》中的分級方法[5],將患者分為3組:獲卵數(shù) ≤4個者,為卵巢低反應組(17例);獲卵數(shù)≥5個且≤14個者分為卵巢正常反應組(83例);獲卵數(shù)≥15個者為卵巢高反應組(20例)。

1.2 主要試劑及儀器

血液基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司],PCR體系試劑[寶生物工程(大連)有限公司],引物(上海捷瑞生物工程有限公司),瓊脂糖(西班牙Oxoid Ltd公司),超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司),Millipore超純水儀(美國Millipore公司),DYY2C電泳儀、DYY-III5電泳槽(北京六一儀器廠),UVP8000型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Millipore公司),梯度PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)。

1.3 實驗方法

實驗操作均嚴格按照《現(xiàn)代分子生物學實驗技術》[6]進行,試劑和儀器的使用參照其說明書進行。參照試劑盒說明書提取DNA,用核酸定量儀測定A260和A280,計算DNA濃度和純度。將DNA純度在 1.8～2.0 μ g·mL-1的標本的濃度稀釋到50 ng·μ L-1,-20 ℃保存,待用。

1.3.1 PCR引物設計及反應體系

參照Falconer H.等[7]采用的引物設計方案,擴增片段長度為 229 bp。上游:5′GCAAGTGTGGCTGCTATGAA 3′,下游 5′GTGACATACCCTTCAAAGGC 3′。

1.3.2 PCR反應體系及循環(huán)條件

反應體系為:10×PCR Buffer 2.5 μ L、MgCl2(25 mmol·L-1)1.5 μ L 、dNT P(各 2.5 mol· L-1)2.0 μ L 、5′Primer(10 μ mol· L-1)0.5 μ L 、3′Primer(10 μ mol · L-1)0.5 μ L 、Taq DNA polymerase(3 U · μ L-1)0.2 μ L 、模板 DNA(100 ng · μ L-1)2.0 μ L 、ddH2O 15.8 μ L,總量 25 μ L 。

PCR反應循環(huán)條件:94℃預變性5 min;94℃變性 1 min、55℃退火1 min、72 ℃延伸1 min,循環(huán)30次;終末延伸72℃7 min;然后放于4℃冰箱保溫待用。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳及測序

PCR產(chǎn)物(與 loading buffer dye 混合成 6 μ L體系)用1.5%瓊脂糖凝膠在 150 V電壓下電泳30 min,電泳緩沖液為0.5×TBE,用UVP8000型凝膠成像分析系統(tǒng)成像,將具有單一明亮條帶的PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司純化并測序。用BLAST對測序結果進行比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有資料采用SPSS10.0軟件進行t檢驗、秩和檢驗及χ2檢驗,P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

1) 各卵巢反應組間基本情況的比較見表1。各卵巢反應組間常用監(jiān)測指標的比較見表2。

2) FSHR的SNP及各SNP在不同卵巢反應組中所占比例:用引物擴增提取的 DNA后得到PCR產(chǎn)物見圖1,所得長度為229 bp的PCR產(chǎn)物在測序后經(jīng)比對證實其確為人類FSH R DNA。測序結果顯示120例不孕婦女中FSHR基因外顯子10上編碼氨基酸的680位SNP,有3種基因型,分別為:Asn680Asn(A/A)、Asn680Ser(A/S)和Ser680Ser(S/S)。SNP的3種測序結果見封四圖2,3種SNP所占比例分別為A/A型占60%、A/S型占17.5%和S/S型占22.5%。

表1 各卵巢反應組間基本情況比較 x±s

表2 各卵巢反應組臨床常用監(jiān)測指標比較 x±s

圖1 FSHR目的基因片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

3) 3種SNP組間基本情況的比較見表3。

4) 3種基因型組間常用監(jiān)測指標的比較見表4。

5) 不同卵巢反應組與不同SNP的構成比:卵巢低反應組中以S/S型為主,占58.82%;卵巢正常反應組和卵巢高反應組中均以A/A型為主,分別占62.65%及75.00%。A/A型與A/S型的卵巢反應相比差異無統(tǒng)計學意義;而A/A型與S/S型間及A/S型與S/S型間的卵巢反應有統(tǒng)計學意義。見表5及封四圖3。

表3 各SNP組基本情況比較 ±s

表3 各SNP組基本情況比較 ±s

組別 n 基礎FSH值/(U·L-1) 年齡/歲 BMI/(kg·m-2)A/A 組 72 5.98±1.90 30.64±2.89 21.21±2.41 A/S組 21 6.03±1.21 6.21±1.42 21.24±3.49 S/S組 27 30.60±3.50 30.33±3.77 21.02±2.63 P 0.665 0.996 0.940

表4 各基因型組臨床常用監(jiān)測指標比較 x±s

表5 不同卵巢反應組各SNP的構成比 %

3 討論

3.1 FSHR基因多態(tài)性

國外的研究結果認為不孕婦女的FSHR基因外顯子10的680位存在基因多態(tài)性,分別為A/A、A/S和S/S 3種基因型,其中S/S或A/S型比率最高[1,7-9]。本研究發(fā)現(xiàn)120例不孕婦女中也存在同樣的基因多態(tài)性,有3種基因型,但3種基因型在患者中所占的比率有所區(qū)別,其中A/A型最多,達到60.00%(72/120)。

3.2 不孕患者卵巢反應與各項臨床指標的關系

在IVF-ET或卵漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治療中,為了制定合理的COS方案,讓患者獲得更多有效的成熟卵泡,從而提高患者的妊娠率,減輕患者的經(jīng)濟和精神負擔,需提前了解患者的卵巢反應性。目前常用的臨床檢測指標有基礎FSH(bFSH)水平、基礎雌二醇(bE2)值、B超下檢測竇卵泡等,但都不能非常準確地預測患者的卵巢儲備情況,所以人們一直試圖尋找一種更好的預測方法。本研究按獲卵數(shù)將患者卵巢反應由低到高分為3組,結果顯示3種卵巢反應組患者的基本條件無顯著性差別。3種卵巢反應類型患者間的AFC、HCG日B超監(jiān)測雙側(cè)卵巢中直徑≥14 mm的卵泡數(shù)、HCG日E2值有明顯差別。本研究結果顯示,3組患者的bFSH值差異并無統(tǒng)計學意義,但卵巢低反應組的bFSH水平較卵巢正常反應組和卵巢高反應組有升高的趨勢。而AFC與卵巢反應成正相關,其數(shù)值越高,卵巢反應越高[10]。說明在臨床常用的預測卵巢反應性的指標中,AFC比bFSH更準確。

3.3 FSHR 3種基因型與卵巢反應性的關系

FSHR基因型可能是卵巢對FSH刺激反應的重要決定因素,尤其是Asn680純合子[8]和Ser680純合子[10-11]。本研究結果顯示不孕婦女中A/A型與S/S型患者的卵巢反應性差異有統(tǒng)計學意義,S/S型比A/A型患者的卵巢反應性低,提示不同基因型與卵巢的反應性可能有關。在卵巢低反應組中以S/S型為主,而A/A型則偏向分布于卵巢高反應組及卵巢正常反應組患者中;S/S基因型在卵巢低反應組中所占的比例最高,而在卵巢高反應組中所占比例最低;A/A型在卵巢正常反應組和卵巢高反應組中所占比例均最高。A/S型者在卵巢低反應組中所占比例均最低。

本研究結果顯示,S/S型的獲卵數(shù)與A/A型和A/S型相比有減少的趨勢,但3種基因型的獲卵數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。該結果提示S/S純合子基因型與卵巢低反應可能有關,這與Perez Mayorga M.等[1-12]研究的結果類似。

Perez Mayorga M.等[1,11-13]認為A/S型和S/S型患者比A/A型的FSH用藥支數(shù)明顯多。本研究結果顯示3種基因型FSH用藥量差異無統(tǒng)計學意義,可能與種族、地域差異及統(tǒng)計人數(shù)不足有關;也可能是由于FSHR的3種基因型是患者對FSH藥物刺激產(chǎn)生不同反應的多種因素中的一種,不能作為預測卵巢反應的單一指標。

綜上所述,不孕婦女FSH R外顯子10的680位存在A/A、A/S和S/S 3種基因型,各基因型在不孕婦女中所占的比率不同,其中A/A型最多。卵巢低反應患者的基因型以S/S型為主,卵巢正常反應者和卵巢高反應者以A/A型為主,提示S/S純合子基因型與卵巢低反應可能有關。如果加大病例數(shù)研究后結果仍和本研究一致的話,則提示對不孕患者FSHR基因型的檢測可能可以作為預測卵巢反應的一項補充指標。隨著科技的不斷進步,基因多態(tài)性的檢測方法會變得越來越簡便和經(jīng)濟,通過檢測患者FSHR基因多態(tài)性并結合其他的相關檢測結果,可能有助于臨床上不孕患者超促排卵用藥方案的選擇和改進,預測患者超促排卵效果,從而提高不孕患者進行IVF-ET或ICSI的成功率,為不孕患者的治療帶來福音。

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