金晨慈，蔣龍翔

(溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 呼吸科，浙江 溫州 325000)

苦參堿（MT）是苦參根及苦豆子等中草藥的活性成分， 是苦參堿類生物堿的代表，屬于四環(huán)的噻嗪啶類，具有抗炎、免疫抑制、抗病毒、抗腫瘤等作用[1-2]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)MT對多種腫瘤細胞有一定的殺傷作用[3]。本研究為苦參堿對人肺鱗癌細胞株SK-MES-1增殖、細胞周期及細胞凋亡的影響， 探討其對人肺鱗癌可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 苦參堿由西安林海生物工程有限公司提供。RPMI1640、胰蛋白酶及胎牛血清為Gibco產(chǎn)品。四甲基偶氮唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DM-SO）、牛血清白蛋白（BSA）均為Sigma公司產(chǎn)品。Bcl-2、bax和caspase-3多克隆抗體購自cellsignal公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人肺鱗癌細胞株SK-MES-1購自中科院細胞庫，常規(guī)培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 MTT法檢測苦參堿對SK-MES-1細胞增殖的影響 取對數(shù)生長期的SK-MES-1細胞，消化后重懸，以5×107/L的密度接種到96孔培養(yǎng)板，每孔加100μL細胞懸液。實驗設對照組、不同濃度藥物組細胞，貼壁后加入不同濃度苦參堿20μL，使其終濃度分別為0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。每組設6個復孔。加入藥物后，分別培養(yǎng)24、48、72 h，每孔加入MTT液（5 g/L）10μL，培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μL DM-So，置酶標儀570 nm波長處，測吸光度值，并按下列公式計算細胞增殖抑制率: 細胞增殖抑制(%)=(1-處理組OD570值/空白對照組OD570值)×100%。實驗重復3次。

1.4 流式細胞儀檢測苦參堿對SK-MES-1細胞凋亡率的影響 取對數(shù)生長的細胞以每瓶2×106的密度接種于培養(yǎng)瓶中，細胞貼壁后，棄上清。加入不同濃度苦參堿20μL，使其終濃度分別為0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。孵育48 h后用0.25%胰酶收集所有細胞，用70%乙醇于4 ℃固定30 min，PBS沖洗殘留乙醇兩次，加入150μL RNase（5 g/L）和150μL PI溶液（50μg/mL）于室溫避光染色30 min后，進行流式細胞儀檢測，計算細胞凋亡率。

1.5 流式細胞儀檢測苦參堿對SK-MES-1細胞周期的影響 取對數(shù)生長的細胞以每瓶2×106的密度接種于培養(yǎng)瓶中。24 h后加入不同濃度苦參堿20μL，使其終濃度分別為0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。37 ℃孵育48 h后用胰酶消化成單細胞懸液，PBS沖洗兩次，加入10μL PI溶液（20μg/mL）和5μL Annexin V混勻，予室溫避光染色15 min后，流式細胞儀檢測細胞周期DNA含量分析，確定細胞周期分布。

1.6 染色流式細胞儀檢測Bcl-2，bax，caspase-3表達 取對數(shù)生長的細胞以每瓶2×106的密度接種于培養(yǎng)瓶中，細胞貼壁后，棄上清。加入不同濃度苦參堿20μL，使其終濃度分別為0、7.5、15、30、60、120、240 mg/L。37 ℃孵育 48 h后收集至10 mL離心管中，PBS洗滌兩次。將每管細胞濃度調(diào)至（0.5～1）×106/mL。加入4%多聚甲醛，室溫固定10 min；加入預冷的90%甲醇（900μL+100μL BSA）破膜；加入一抗室溫放置1 h；然后加入FITC標記二抗2μL孵育30 min（避光）。將細胞懸液移入12 mm×75 mm的試管內(nèi)，以流式細胞儀測FITC的熒光強度。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 MT對SK-MES-1細胞增殖的抑制作用 MTT法檢測結(jié)果表明：與對照組相比，苦參堿能顯著抑制SK-MES-1細胞的增殖， 并有明顯的劑量效應及時間效應關(guān)系（見圖1）。

圖1 SK-MES-1細胞在苦參堿作用下的量效曲線

2.2 MT對SK-MES-1細胞凋亡及細胞周期的影響流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，苦參堿處理后的SK-MES-1細胞凋亡率增加，并與給藥濃度成正比。并且SK-MES-1細胞在G0/G1期的比例增高，在S期的比例降低，并有劑量依賴性（見表1）。

表1 不同濃度苦參堿作用SK-MES-1細胞凋亡率和周期時相分布（%）

表2 SK-MES-1細胞相關(guān)凋亡蛋白Bcl-2、bax、caspase-3表達比較（熒光強度）

2.3 MT對SK-MES-1細胞蛋白表達的影響 流式細胞儀檢測結(jié)果表明：與對照組相比，苦參堿處理后的SK-MES-1細胞bax和capase-3表達增強，Bcl-2表達下調(diào)，并有劑量依賴性（見表2）。

3 討論

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其病理類型中又以鱗狀上皮細胞癌最常見，約占原發(fā)性肺癌的40%～50%。肺癌的治療是多學科綜合的治療(主要包括外科切除、放射治療、化學治療)[4]。目前的常規(guī)化療藥物盡管其抑制或殺傷腫瘤細胞的作用肯定，但其毒副作用及多藥耐藥性難以克服。隨著中醫(yī)對肺癌認識的深入，中醫(yī)藥在改善肺癌患者癥狀、提高患者生存質(zhì)量、延長生存期及配合西醫(yī)增效減毒等方面的優(yōu)勢得到了認同[5]。

苦參堿具有多種生物活性，對于胃癌[6]、白血病[7]、宮頸癌[8]和肝癌[9]等多種腫瘤細胞具有抑制作用。近年來研究表明：①苦參堿可誘導細胞發(fā)生凋亡，其作用效果與濃度呈正相關(guān)?？鄥A促使腫瘤細胞凋亡的原因可能是苦參堿影響了腫瘤相關(guān)基因的表達[10]。②苦參堿抑制腫瘤細胞增殖和誘導分化，可使細胞發(fā)生S期阻滯。這可能與端粒酶、細胞周期蛋白、增殖相關(guān)基因有關(guān)。③抗腫瘤細胞黏附與浸潤轉(zhuǎn)移[3]。在臨床上，代志軍等[11]等研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿能提高中晚期肺鱗癌化療患者的免疫功能，減輕化療的毒副作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度苦參堿(7.5、15、30、60、120、240 mg/L)對人肺鱗癌細胞株SK-MES-1有不同程度的增殖抑制作用，且隨著作用濃度的增高和作用時間的延長，細胞增殖受抑更為明顯，提示苦參堿對SK-MES-1細胞的增殖有抑制作用，并有一定的劑量效應及時間效應關(guān)系。通過流式細胞分析發(fā)現(xiàn)，7.5、15、30、60、120、240 mg/L苦參堿作用48 h后，可使G0/G1期細胞比例較對照組增多且比例逐漸升高，G2/S期細胞比例減少，存在G0/G1期阻滯。通過以上研究結(jié)果， 我們推測：苦參堿可以影響腫瘤細胞內(nèi)DNA的復制和合成，抑制細胞的正常分裂；抑制細胞進入S期，從而使細胞在G1期堆積，出現(xiàn)G2/M阻滯，阻止細胞進行有絲分裂，從而抑制細胞的增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，苦參堿處理后的SK-MES-1細胞凋亡率增加。Bcl-2是細胞的抗凋亡因子，有穩(wěn)定線粒體膜，阻止線粒體釋放caspase，阻遏氧自由基誘導凋亡信號通路的作用[12]。通常情況下，Bcl-2與促凋亡基因bax結(jié)合，以二聚體的形式存在[13]。當Bcl-2減少和bax增加時，細胞易于凋亡，反之細胞免遭凋亡。caspase-3是引起細胞凋亡的具體執(zhí)行酶，是細胞凋亡的主要效應因子[14]。本研究觀察MT可以促進SK-MES-1細胞的bax和capase-3表達，抑制Bcl-2表達，從而說明MT可能通過抑制Bcl-2和激活bax，減少細胞色素C的釋放，激活caspase-3進而激活caspase蛋白酶家族，誘導細胞凋亡的發(fā)生。然而細胞凋亡是一個多因素參與的復雜過程，其具體機制還需進一步研究。

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