樊有龍,傅穎媛

(1.南昌大學第二附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006;2.南昌大學醫(yī)學院,江西 南昌 330006)

類風濕關(guān)節(jié)炎患者AECA 、VEGF、IL-17的檢測及臨床相關(guān)性研究

樊有龍1,2,傅穎媛2*

(1.南昌大學第二附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006;2.南昌大學醫(yī)學院,江西 南昌 330006)

目的通過對類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者血清抗血管內(nèi)皮細胞抗體(Anti endothelial cell antibodies,AECA)、血漿血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)的檢測,以探討AECA、VEGF、IL-17在RA患者發(fā)病、病情進展中的相關(guān)性及其內(nèi)在聯(lián)系。方法采用間接免疫熒光法(IIF)和雙抗體夾心ELISA法檢測86例 RA、45例骨關(guān)節(jié)炎(OA)、30例健康對照AECA的陽性率和VEGF、IL-17水平,VEGF、IL-17水平與紅細胞沉降率(ESR)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、類風濕因子(RF)等指標進行相關(guān)性分析。結(jié)果RA患者AECA陽性率為8.1%,高于OA患者的陽性率2.2%和健康對對照的陽性率0%(P＜0.05);R A活動期AECA陽性率為16.7%,高于RA緩解期的陽性率3.6%(P＜0.05);RA患者血漿IL-17和VEGF水平顯著高于OA組和健康對照組(P＜0.05);RA患者活動期血漿IL-17和VEGF水平明顯高于RA緩解組及健康對照組(P＜0.01);RA患者AECA滴度、血漿 IL-17、VEGF水平與 ESR、hs-CRP、RF的指標呈正相關(guān)。結(jié)論AECA、VEGF、IL-17三者與RA的發(fā)病、病情活動存在一定的關(guān)系,IL-17、VEGF水平變化及AECA的滴度可作為臨床觀察RA病情活動、判斷療效及預后等方面的參考指標。

類風濕關(guān)節(jié)炎;白細胞介素-17;血管內(nèi)皮生長因子;抗血管內(nèi)皮細胞抗體

類風溫關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)滑膜中血管病變的存在與RA發(fā)病、發(fā)展以及并發(fā)癥的出現(xiàn)有關(guān)。AECA 、VEGF、IL-17與血管炎癥反應(yīng)、血管新生、關(guān)節(jié)滑膜血管病變均存在一定的內(nèi)在聯(lián)系,目前國內(nèi)對AECA 、VEGF、IL-17三者在RA的發(fā)病及血管病變等方面的作用報道較少,故探討AECA、VEGF、IL-17在RA中的發(fā)病及病情進展中的作用機制,對RA的診斷治療及發(fā)病機制研究具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 對象

1.1.1 RA組 2005年6月-2008年12月收集南昌大學第二附屬醫(yī)院、南昌大學第一附屬醫(yī)院、江西省中醫(yī)院RA住院患者86例,均符合1987年美國風濕病學會(American Rheumatism Association,ARA)RA診斷標準,年齡19-66歲,平均41.7歲,86例RA患者中男性33例,女性53例,按照1987年ARA制定的RA分類標準[1],86例RA患者中活動期患者30例,緩解期患者56例,所有RA患者均排除其他風濕性疾病、感染等。

1.1.2 OA組 45例OA患者,年齡 13-65歲,平均43.2歲,男性28例,女性17例,符合1986年美國風濕病學會(ARA)原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎診斷標準[2]。

1.1.3 對照組 30例本院體檢健康者標本,所選標本年齡、性別等與病例標本相匹配。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 檢查對象采空腹靜脈血3管,一管為血清,用于 hs-CRP、RF、AECA檢測。另一管全血1.6 ml置于0.4 ml 3.8%枸櫞酸鈉抗凝管中,用于ESR檢測.第3管1.8 ml全血置0.2 ml 0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝管中,分離血漿,分裝后置-70℃保存,用于檢測VEGF、IL-17。

1.2.2 VEGF、IL-17檢測 采用雙抗體夾心ABCELISA法,IL-17試劑盒由南昌長城生物科技有限公司提供,批號為20090312,VEGF試劑盒由上海森雄公司進口分裝試劑,批號為20090417,嚴格按說明書操作,采用美國寶特Elx-800型酶標儀于450 nm波長處測定OD值,以O(shè)D值為縱坐標,以標準品濃度為橫坐標通過繪制標準曲線計算樣本的濃度。

1.2.3 AECA檢測 間接免疫熒光法(IIF)檢測,參照文獻[3],試劑盒為德國歐蒙實驗診斷公司提供的原裝進口試劑,批號20081105,嚴格按說明書操作,陽性標本倍比稀釋檢測AECA滴度。

1.2.4 ESR檢測 抗凝血于全自動動態(tài)血沉儀(DRAGONMED?2010型)檢測,記錄檢測結(jié)果。

1.2.5 hs-CRP、RF檢測 采用速率散射免疫比濁法定量檢測,儀器為德靈(DADE BEHRING INC)診斷(上海)公司產(chǎn)品及配套試劑。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS11.5 forwindows軟件系統(tǒng)處理,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間的比較采用 t檢驗。陽性率比較采用Fisher確切概率法。各指標之間的相關(guān)性檢驗采用pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 RA患者組與OA組、健康對照組血漿VEGF、IL-17檢測 結(jié)果比較見表1,RA患者血漿VEGF、IL-17水平顯著高于OA組和對照組,OA組與對照組無統(tǒng)計學差異。

表1 RA患者組與OA組、對照組血漿VEGF、IL-17水平比較(±s)

表1 RA患者組與OA組、對照組血漿VEGF、IL-17水平比較(±s)

注:*RA組與OA組、對照組比較(P＜0.05),△OA組與對照組比較(P＞0.05)

組別 n VEGF(ρ g/ml) IL-17(ρ g/ml)RA 組 86 48.45±22.13* 42.18±19.22*OA 組 45 16.35±7.63△ 13.17±5.78△對照組 30 13.26±6.59 10.31±3.29

2.2 RA活動組、緩解組與對照組血漿VEGF、IL-17檢測 結(jié)果見表2,RA活動組血漿VEGF和IL-17水平顯著高于緩解組、對照組,RA緩解組與對照組無明顯差異。

表2 RA活動組、緩解組與對照組血漿VEGF、IL-17 水平(±s)

表2 RA活動組、緩解組與對照組血漿VEGF、IL-17 水平(±s)

組別 n VEGF(ρ g/ml) IL-17(ρ g/ml)活動組 30 65.35±12.33* 72.36±16.93*緩解組 56 16.12±10.37△ 17.38±13.47△對照組 30 13.26±6.59 10.31±3.29

注:*RA活動組與緩解組、對照組比較(P＜0.01),RA緩解組與對照組無明顯差異(P＞0.05)

2.3 AECA檢測結(jié)果 見表3。AECA滴度與活動性明顯相關(guān)(P＜0.05)。

表3 各組全血AECA檢測結(jié)果比較

2.4 RA患者AECA陽性組與AECA陰性組血漿VEGF、IL-17水平見表4,RA患者AECA陽性組血漿VEGF、IL-17水平明顯高于AECA陰性組。

表4 RA患者AECA陽性組與AECA陰性組血漿VEGF、IL-17 水平(±s)

表4 RA患者AECA陽性組與AECA陰性組血漿VEGF、IL-17 水平(±s)

注:*RA患者AECA陽性組與AECA陰性組比較(P＜0.05)

組別 例數(shù) VEGF(ρ g/ml) IL-17(ρ g/ml)AECA陽性組 30 62.46±10.28* 48.52±13.25*AECA陰性組 56 18.57±12.66 21.65±15.32

2.5 RA活動組血漿VEGF、IL-17水平,AECA陽性滴度與ESR、hs-CRP、RF的相關(guān)性分析見表5,RA患者AECA滴度、血漿 IL-17、VEGF水平與 ESR、hs-CRP、RF指標呈正相關(guān)關(guān)系。

從表5可以看出,RA活動組VEGF、IL-17水平,AECA陽性滴度與ESR、hs-CRP、RF、關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、Ritchie指數(shù)、病程呈正相關(guān)(P＜0.01或P＜0.05);RA活動組VEGF、IL-17水平,AECA陽性滴度與晨僵時間無明顯相關(guān)性。

表5 RA活動組VEGF、IL-17水平,AECA陽性滴度與ESR、hs-CRP、RF的相關(guān)性分析

3 討論

國外研究表明,AECA參與血管損傷[4],是反映血管內(nèi)皮細胞受損的分子標志物[5]。AECA作為血管內(nèi)皮細胞的特異性抗體,可通過改變內(nèi)皮細胞功能或通過激活補體或抗體依賴細胞介導的細胞毒作用而使血管內(nèi)皮活化損傷。血管內(nèi)皮損,基底膜抗原充分暴露,抗體與抗體結(jié)合形成免疫復合物,故AECA可能是間接或直接觸發(fā)血管病變的重要因素之一[3]。

血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)又稱血管滲透因子(Vascular Permeability Factor,VPF),是由2個相同的多肽鏈通過二硫鍵構(gòu)成的二聚體,相對分子質(zhì)量約為45 000 Da,VEGF與其受體(VEGFR)特異性結(jié)合具有促進血管內(nèi)皮細胞增殖、促進炎癥反應(yīng)和新生血管的形成等多重作用,參與RA的發(fā)病機制及病理改變等[6]。IL-17(interleukin-17,IL-17)主要由活化的記憶性CD4+T淋巴細胞分泌,是含有一個N-末端信號肽的155個氨基酸的糖蛋白,是新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子,是一種重要的前致炎細胞因子,在RA的發(fā)病中,IL-17可與其他細胞因子相互作用,相互調(diào)節(jié),促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生[7]。IL-17刺激血管內(nèi)皮細胞遷移和血管索形成,并上調(diào)多種血管形成因子表達,有促血管形成作用[8-9]。RA中VEGF水平的升高,可顯著提高血管的通透性,加重炎癥過程,同時VEGF對單核細胞、淋巴細胞有趨化激活作用,促進T淋巴細胞等炎性細胞分泌IL-17等炎性細胞因子。IL-17和VEGF的相互關(guān)系還表現(xiàn)在RA關(guān)節(jié)軟骨的破壞、關(guān)節(jié)畸形等病理過程中,IL-17通過刺激滑膜細胞泌KGF、HGF、HB-EGF[10],刺激血管內(nèi)皮細胞分泌VEGF等血管因子促進血管翳的形成,IL-17還通過誘導滑膜細胞和軟骨細胞表達金屬蛋白酶,使蛋白多糖分子斷裂,破壞軟骨組織,刺激破骨細胞的生長[11];同時炎性細胞浸潤引起關(guān)節(jié)的破壞和產(chǎn)生防御性修復,多方面因素造成炎癥反應(yīng)、關(guān)節(jié)滑膜損傷、關(guān)節(jié)軟骨破壞和關(guān)節(jié)變形等病理改變。

從我們研究結(jié)果表明,RA患者血漿VEGF和IL-17水平顯著高于OA組和健康對照組(P＜0.05),RA患者AECA陽性率為8.1%高于OA患者的陽性率2.2%和健康對對照的陽性率0%(P＜0.05),RA患者活動期血漿IL-17和VEGF水平明顯高于RA緩解組及健康對照組(P＜0.01),RA活動期AECA陽性率為16.7%高于RA緩解期的陽性率3.6%(P＜0.05),RA患者AECA陽性組與AECA陰性組比較(P＜0.05),均提示AECA 、VEGF、IL-17與RA的發(fā)病及病情進展存在一定的關(guān)系,它們在血管炎癥、血管增生及血管翳的形成等方面作用應(yīng)引起臨床研究的重視。另外,RA患者AECA滴度、血漿IL-17、VEGF 水平與與ESR、hs-CRP、RF、關(guān)節(jié)疼痛指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)、Ritchie指數(shù)、病程呈正相關(guān)呈正相關(guān),說明血漿IL-17、VEGF水平變化及AECA的滴度可作為臨床觀察RA病情活動、判斷療效及預后等方面的參考指標。

目前國內(nèi)對AECA 、VEGF、IL-17三者在RA的發(fā)病及血管病變等方面的作用報道較少,三者在RA發(fā)病中的作用,尤其是RA血管病變中的作用機制仍然值得我們進一步探討,以便為RA臨床診斷和治療、減少RA并發(fā)癥的發(fā)生及提高RA患者的生活質(zhì)量等方面提供實驗診斷參考依據(jù)。

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The detection of AECA,VEGF and IL-17 and the study of their correlation in patients with Rheumatoid Arthritis

FAN You-long1,FUYing-yuan2*.(1.The Second Affitiated Hospital of Nanchang University Nanchang330006,China;2.Medical College of Nanchang University,Nanchang330006,China)

ObjectiveTo investigate the clinical significance of plasma Anti endothelial cell antibodies(AECA),vascular endothelial growth factor(VEGF)and interleukin-17(IL-17)in patientswith rheumatoid arthritis.MethodsAECA,VEGF and IL-17 were detected in 86 cases of rheumatoid arthritis,45 cases of osteoarthritis(OA)and 30 healthy controls by indirect immunofluorescence(IIF)and by double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The correlation analysis was done among above results and erythrocyte sedimentation rate(ESR),high-sensitivity C-reactive protein(hs-CRP),rheumatoid factor(RF)for correlation!analysis.ResultsThe positive rate of AECA in patients with RA(8.1%)was much higher than that in patients with OA(2.2%)and in the normal group(0%)(P＜0.05).The plasma level of IL-17 andVEGF of RA patients were significantly higher than that of OA patients and the normal control(P＜0.05);plasma level of IL-17 and VEGF of active RA patientswere significantly higher than that of RA remission group and healthy control group(P＜0.01),but there was no significant difference between RA remission group and healthy control group(P＞0.05);The titer of AECA,plasma IL-17 andVEGF of R A patients are positively correlatedwith ESR、hs-CRP、RF.ConclusionAECA、VEGF and IL-17 are correlated with the pathogenesis and activity of RA.they can be used as important indicators for the disease activity,therapeutic effect,prognosis of patientswith RA.

Rheumatoid arthritis;interleukin-17;Vascular endothelial growth factor;Anti endothelial cell antibodies(Chin J Lab Diagn,2010,14:0907)

R593.22

A

1007-4287(2010)06-0907-04

江西省教育廳資助項目(項目編號:GJJ09099)

*通訊作者

樊有龍(1973-),男,副教授,副主任技師,主要從事分子和細胞免疫學研究。

2009-06-18)