許傳杰,劉林林,王貴全,何 旭,朱桂彬,李玉林*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 病理科,吉林長春 130041;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 放療科;3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院科教科;4.吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點實驗室)

PEX基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其體外對微血管生成的影響

許傳杰1,劉林林2,王貴全3,何 旭4,朱桂彬4,李玉林4*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 病理科,吉林長春 130041;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 放療科;3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院科教科;4.吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點實驗室)

目的探討PEX基因在體外對微血管生成的影響。方法利用RT-PCR、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)小管形成實驗及雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管形成實驗,體外觀察PEX基因?qū)ρ苌傻挠绊?。結(jié)果穩(wěn)定篩選的細(xì)胞株BpcDNA-sPEX經(jīng)RT-PCR可擴(kuò)增出sPEX帶;bFGF+BpcDNA-sPEX組小管數(shù)明顯少于bFGF+BpcDNA、bFGF+B16F10組(P＜0.01);bFGF+BpcDNA-sPEX組血管分支點數(shù)明顯少于bFGF+BpcDNA、bFGF+B16F10組(P＜0.01)。結(jié)論P(yáng)EX基因能夠抑制由bFGF誘導(dǎo)的CAM血管的新生、PEX基因能夠阻抑bFGF對小管形成的促進(jìn)作用。

PEX基因;RT-PCR;微血管生成

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0014)

Brooks等發(fā)現(xiàn)MMP-2可通過C端與整合素蛋白家族成員α vβ3結(jié)合,激活自身催化活性,產(chǎn)生 C端類血紅素結(jié)合片斷PEX(Hemopexin),該片斷可抑制MMP-2對ECM降解和血管的形成[1,2],提示PEX片斷有可能成為抗腫瘤血管生成新的生物活性藥物。目前對PEX基因的研究僅限于原核表達(dá)載體所表達(dá)的PEX融合蛋白對微血管生成的影響,因此本研究在構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-sPEX的基礎(chǔ)上,體外觀察PEX基因?qū)ξ⒀苌傻挠绊憽?/p>

1 材料與方法

1.1 穩(wěn)定篩選的細(xì)胞株BpcDNA-sPEX、BpcDNA獲得見已文獻(xiàn)[3]。B16F10細(xì)胞株購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所,以上三株細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2 TRIzol試劑分別提取BpcDNA-sPEX、BpcDNA、B16F10細(xì)胞總RNA,經(jīng)RT-PCR,觀察各個細(xì)胞株sPEX的表達(dá)情況,PCR反應(yīng)條件為:94℃10 s、55℃30 s、72℃50 s,30個循環(huán),全部循環(huán)結(jié)束后,于72℃做5min終止前延伸。用GAPDH做內(nèi)對照。

1.3 HUVEC小管形成實驗 將Matrigel置4℃融化 ,包被于 24孔板內(nèi) ,每孔 320 μ l,37℃孵育30 min;生長狀態(tài)良好的HUVEC接種于Matrigel包被的24孔板內(nèi),每孔25 000個/75 μ l;各孔內(nèi)分別加入以下條件培養(yǎng)基:10%LSGS的M200培養(yǎng)液(對照組),bFGF,bFGF+BpcDNA-sPEX上清,bFGF+BpcDNA上清,bFGF+B16F10上清,各組bFGF的濃度均為30 ng/ml,37℃孵育30 min;加含10%低血清生長因子添加劑(LSGS)的 M200 培養(yǎng)液 150 μ l,37℃、5%CO2及飽和濕度環(huán)境下孵育6 h;PBS洗細(xì)胞2次,每次5 min,4%多聚甲醛固定15 min;在倒置顯微鏡下觀察 、計數(shù) 。

1.4 CAM血管形成實驗 取9日齡雞胚,無菌H2O2洗凈,1/4 000甲醛擦拭后,涼干;將雞胚置檢卵燈下尋找胚頭,在距胚頭前1cm,兩條前卵黃靜脈之間的卵殼投影部位,用蠟筆畫出1 cm×1.5 cm長方形區(qū);在雞胚氣室端鉆約1.0 mm-2.0 mm小孔并穿透氣室殼膜;在蛋殼開窗位置,用75%酒精消毒后,用小銼刀沿長方形區(qū)的邊線磨切透卵殼(切勿傷及下方的卵殼膜);用眼科鑷夾住長方形卵殼膜,平行上提,暴露下方的卵殼膜;注射針頭循殼膜纖維方向劃破直徑1 mm小孔,不可傷及下方CAM;在殼膜窗上滴加無菌生理鹽水少許,然后用眼科鑷輕輕撥起小孔邊緣卵殼膜,讓液體浸入卵殼膜與CAM之間,CAM下沉后,剪除長方框內(nèi)卵殼膜;將直徑0.5 mm濾紙放置于CAM上無血管區(qū),在CAM上分別加入以下物質(zhì),依照加入物質(zhì)的不同而將實驗分成五組,A組:無菌生理鹽水;B組:30 μ g/ml bFGF;C組:30 μ g/ml bFGF+BpcDNA-sPEX 細(xì)胞上清;D組:30 μ g/ml bFGF+BpcDNA 細(xì) 胞上清 ;E 組:30 μ g/ml bFGF+B16F10細(xì)胞上清;用滅菌透明膠帶封住卵窗,放入恒溫箱內(nèi)孵育(37℃、濕度70%);72 h后,取出雞胚,局部滴加甲醇、丙酮等量混合固定液,室溫下固定15 min;待CAM上的血管內(nèi)血液凝固后,將測試區(qū)域的CAM剪下,置于盛有H2O2的碟皿中,用彎頭吸管展開后,傾去皿中的H2O2,在皿底攤平CAM,翻轉(zhuǎn)貼于濾紙上,記錄結(jié)果。在解剖顯微鏡下計數(shù)濾紙區(qū)域內(nèi)可見血管的分支點數(shù)量,統(tǒng)計學(xué)方法采用±s表示測定結(jié)果,平均數(shù)之間的比較采用方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定篩選的細(xì)胞株BpcDNA-sPEX、BpcDNA及親代細(xì)胞B16F10,經(jīng) RT-PCR,可見從BpcDNA-sPEX細(xì)胞中擴(kuò)增出678 bp的 sPEX帶,而在BpcDNA、B16F10細(xì)胞中未擴(kuò)增出目的基因,只見GAPDH帶。見圖1。

圖1 BpcDNA-sPEX細(xì)胞RT-PCR結(jié)果

2.2 PEX基因?qū)UVEC小管形成的影響

HUVEC在Matrigel膠包被的孔板內(nèi)可形成小管樣結(jié)構(gòu)。bFGF+PEX組小管形成的數(shù)量與bFGF+BpcDNA組、bFGF+B16F10組相比,統(tǒng)計學(xué)上存在著顯著差異(P＜0.01),bFGF+BpcDNA-sPEX組小管數(shù)明顯少于 bFGF+BpcDNA、bFGF+B16F10組;bFGF+BpcDNA組與bFGF+B16組相比,小管數(shù)量沒有明顯差別(P＞0.05)。見表1。

表1 不同組別HUVEC形成小管數(shù)量

2.3 PEX基因?qū)AM新生血管的抑制作用

在9日齡CAM上分別加入上述不同物質(zhì),72 h后可見:B組的血管分支點數(shù)明顯高于A組,C組的血管分支點數(shù)與B組相比,統(tǒng)計學(xué)上有著顯著性差異(P＜0.01),C組的血管分支點數(shù)明顯低于B組,D組和E組血管分支點數(shù)與B組相比,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理沒有顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)果見表2。

表2 不同組別CAM血管指數(shù)

3 討論

腫瘤生長和轉(zhuǎn)移是一個依賴于血管的過程,新生的血管將腫瘤細(xì)胞和微循環(huán)系統(tǒng)直接聯(lián)系起來,不僅使腫瘤生長的物質(zhì)交換得以進(jìn)行,同時新生血管還可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移的通道。有實驗表明[4],原發(fā)腫瘤在血管形成前,腫瘤細(xì)胞是很少進(jìn)入血液循環(huán),但在血管形成之后,入血的瘤細(xì)胞卻是持續(xù)的,進(jìn)入血液的腫瘤細(xì)胞數(shù)與腫瘤血管密度密切相關(guān)。

血管新生是一個多種因子調(diào)控的復(fù)雜過程,正負(fù)兩類調(diào)節(jié)因子的相互作用決定了血管形成的全程,而此過程的最終結(jié)果是形成了新生的微血管。Ausprunk等人[5]曾利用電子顯微鏡對毛細(xì)血管的形成進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在新的毛細(xì)管圍成環(huán)狀、新合成的細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積、鋪墊后,血管環(huán)前端新合成的基底膜(BM)就開始了MMPs所介導(dǎo)的蛋白水解過程,內(nèi)皮細(xì)胞浸潤就從水解局部開始,形成一個新的毛細(xì)血管芽,隨后又接續(xù)了一系列細(xì)胞外蛋白水解的活化與抑制的動態(tài)循環(huán)過程。為了更直接地觀察MMPs對內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化方面的作用,研究人員采用了體外細(xì)胞培養(yǎng)[6],發(fā)現(xiàn)當(dāng)將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于BM樣物質(zhì)(Matrigel)上時,內(nèi)皮細(xì)胞很快排成直線,圍成管狀,編織成血管網(wǎng)。用明膠酶譜分析檢測出培養(yǎng)上清中含有大量活化的MMP2與MMP9,額外添加這兩種酶的人工抗體,或TIMP1、TIMP2,發(fā)現(xiàn)人工抗體與組織抑制物的作用效果相似,均可降低甚至完全阻遏Matrigel上內(nèi)皮細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)的形成。為了明確PEX基因?qū)UVEC體外成管影響,我們設(shè)計了一組條件培養(yǎng)基對比實驗。實驗顯示:單純加入堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)能明顯促進(jìn)小管的形成;bFGF+BpcDNA-sPEX上清組小管形成的數(shù)量與單純bFGF組相比有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01),bFGF+BpcDNA-sPEX上清組小管數(shù)明顯少于bFGF組;bFGF+BpcDNA、bFGF+B16上清組與單純bFGF組相比,小管形成數(shù)沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。說明bFGF能提高HUVEC形成小管的能力,而PEX基因可阻斷bFGF對HUVEC體外成管的促進(jìn)作用。

有研究表明,在雞胚尿囊膜和兔角膜血管生成模型中,bFGF能引起αvβ3整合素的表達(dá)上升,誘導(dǎo)新生血管生成,用拮抗αvβ3整合素的單克隆抗體能抑制 αvβ3整合素誘導(dǎo)血管生成的反應(yīng),表明 αvβ3整合素參與bFGF誘導(dǎo)的血管生成[7]。我們在9日齡CAM上分別加入不同的作用物質(zhì),結(jié)果顯示:bFGF能促進(jìn)CAM血管發(fā)生,而PEX基因能夠阻滯bFGF對CAM血管發(fā)生的促進(jìn)作用。說明PEX基因不僅能抑制腫瘤血管生成,還阻滯雞胚絨毛尿囊膜血管新生。PEX是否與整合素αvβ3相互作用從而抑制了bFGF介導(dǎo)的雞胚絨毛尿囊膜新生血管的形成,還有待于進(jìn)一步探討。

目前,抗血管生成治療腫瘤的研究多是先提純蛋白,再用于實驗,但蛋白的提取、純化等步驟較為繁瑣,且條件要求很高,原核表達(dá)的蛋白較難滿足實驗要求,因此本實驗首次在構(gòu)建了pcDNA3.1-sPEX真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,體外觀察了PEX基因?qū)ξ⒀苌傻挠绊?為PEX片斷有可能成為抗腫瘤血管生成的新生物活性藥物奠定理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

[1]Brooks PC,Sillettl S,Von Schalscha TL,et al.Disruption of angiogenesi109pd by PEX,a noncatalytic metallopproteinase fragment with integrin binding activity[J].Cell,1998,92(3):391.

[2]李金萍,張光謀,柯 楊,等.基質(zhì)金屬蛋白酶-2 C端片段PEX的原核表達(dá)及其對血管發(fā)生的抑制作用[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2002,29(1):120.

[3]許偉杰,李玉林,李一雷.基質(zhì)金屬蛋白酶-2 C端片斷pex的克隆,測序及真核表達(dá)的構(gòu)建[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2003,29(5):591.

[4]Giobron MA,Cotran RS,Leapman,et al.Tumor growth and neovascularization:An experimental model using rabbit cornea[J].J Natl Cancer Inst,1974,72(5):413.

[5]Ausprunk DH,Folkman J.Migration and proliferation of endothelial cells in performed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis[J].Microvasc Res,1977,14:53.

[6]Goede V,Schmidt T,Kimmina S,et al.Analysis of blood vesselmaturation processes during cyclic ovarian angiogenesis[J].Lab Invest,1998,78:1385.

[7]Montgomery AM,Reisfeld RA,Cheresh DA.Integrin alpha v beta 3 rescues melanoma cells from apoptosis in three-dimensional dermal collagen[J].J Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:8856.

expression of PEX genes in thetumor cell and effect on microvascular formation in vitro

XU Chuan-jie,LIU Lin-lin,WANG Gui-quan,et al.(Dept.of Pathology,The Second Hospital Jilin University,Changchun130041,China)

ObjectivePurpose To approach the possible effects of PEX genes on microvascular formation in vitro.MethodsUsing RT-PCR,matrigel capillary-like tube structure formation assay on human umbilical vein endothelial cells(HUVEC),and chick chorioallantoic membrane(CAM)assay methods to examine the effects of PEX genes on microvascular formation in vitro.ResultsRT-PCR results indicated that sPEX m RNA expressed in the BpcDNA-sPEX-positive cell line.with bFGF+BpcDNA or bFGF+B16F10 treatment,bFGF+BpcDNA-sPEX treatment not only induced a significantly decrease in the amount of capillary-like tube(P＜0.01)but also resulted in a significantly decrease in the amount of branch vessels(P＜0.01).ConclusionPEX genes can inhibit bFGF-induced CAM vascular neogenesis,and prevent bFGF-induced enhancement inmatrigel capillary-like tube structure formation.

PEX gene;RT-PCR;microvascular formation

Q78

A

1007-4287(2010)01-0014-03

*通訊作者

許傳杰,40歲,女,博士,副教授,主要研究方向:腫瘤分子病理學(xué)。

2008-03-09)