張幼芳浙江警察學(xué)院,浙江杭州 310053
進入21世紀后,法庭科學(xué)中一個新的專業(yè)——微生物物證檢驗逐漸興起,這一方面是由于社會發(fā)展存在的問題,將微生物作為武器進行恐怖襲擊和犯罪的案例時有發(fā)生;另一方面,也因為生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,微生物物證檢驗技術(shù)得到了不斷發(fā)展。
微生物物證主要為細菌、病毒、真菌等可能涉及犯罪的微生物。物證檢材可以是生物制劑的原始物品,被微生物制劑污染的物品,盛放微生物制劑的容器,被微生物感染的人或動物樣本,攜帶有現(xiàn)場微生物的物品等。
生物恐怖是造成社會恐怖的最嚴重的犯罪形式之一。美國“9 ·11”之后出現(xiàn)的炭疽桿菌信件攻擊事件,讓我們看到生物恐怖襲擊已經(jīng)從可能變成為現(xiàn)實。該類微生物物證常為微生物制劑原始物品,通過郵件或其他方式轉(zhuǎn)移到被害人,常見檢材為被微生物制劑污染的物品,盛放微生物制劑的容器,通過檢測,可確定是否為生物恐怖活動,為何種致病微生物,從而為打擊犯罪,采取相應(yīng)的保護預(yù)防措施提供依據(jù)。
生物犯罪是指故意使用致病微生物導(dǎo)致人、動物和植物發(fā)病,威脅人類健康,破壞農(nóng)畜牧業(yè)發(fā)展和食品安全的犯罪行為[1]。如艾滋病人故意傳播艾滋病毒,導(dǎo)致他人患病[2]。常用檢材為被微生物感染的人或動植物樣本,通過檢測,確定微生物的來源,從而認定犯罪。
在有些案件中,涉嫌病人在醫(yī)院內(nèi)的感染,為確定醫(yī)院是否負有責任,也需對微生物的來源進行認定。
微生物物證可在案犯實施犯罪過程中發(fā)生轉(zhuǎn)移,如發(fā)生在野外的案件,嫌疑人常在不經(jīng)意間將現(xiàn)場的泥土黏附在鞋子、衣服上攜帶走,通過檢測泥土中的微生物,將其與現(xiàn)場泥土比對,可將嫌疑人與犯罪聯(lián)系起來。
微生物物證檢驗的檢測技術(shù)主要有物理分析技術(shù)、免疫學(xué)分析技術(shù)、化學(xué)分析技術(shù)和DNA分析技術(shù),其中,DNA分析技術(shù)是微生物物證檢驗最有力的方法,不僅可以準確檢測微生物種類,還可能鑒別菌毒株或亞株;同時,DNA作為法庭證據(jù),也容易被人們接受。
在聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)應(yīng)用之前,用于微生物檢驗的DNA分析技術(shù)僅局限于雜交技術(shù)和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分型,這些方法所需檢材量大,耗時、費力,不易自動化操作。對特定序列的擴增手段為微生物檢測提供了寬廣的技術(shù)基礎(chǔ)。
細菌中有3種核糖體RNA,分別為5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA, rRNA基因有保守區(qū)和可變區(qū),16S rRNA的對應(yīng)基因為16S rDNA,在3種核糖體RNA中,5S rRNA因核苷酸太少,沒有足夠的遺傳信息用于分類,23S rRNA含有的核苷酸約為16S rRNA的兩倍,分析比較困難,16S rRNA所含核苷酸適中,又具有保守型和存在普遍性,序列變化與進化距離相適應(yīng),檢測技術(shù)流程為,先將細菌進行培養(yǎng),提取基因組DNA,然后根據(jù)已發(fā)表的16S rDNA序列設(shè)計引物,進行PCR擴增,然后電泳分離回收擴增產(chǎn)物,對擴增產(chǎn)物測序,將測序結(jié)果與核糖體基因數(shù)據(jù)庫(現(xiàn)在已有數(shù)千種微生物16S rRNA基因序列數(shù)據(jù))進行比對,確定該未知菌的種屬。
不幸的是,在病毒中沒有可用于區(qū)分種屬的共同的基因。但是在真菌中,核糖體轉(zhuǎn)錄區(qū)包括5S、5.8S、18S和28SrDNA,18S、5. 8S、28S rDNA基因序列進化緩慢而相對保守,但這3個基因序列之間的ITS序列的進化則相當迅速,因而其序列廣泛用于真菌各級水平的系統(tǒng)學(xué)研究[3]。
僅僅根據(jù)一個或2個DNA區(qū)域鑒定微生物種類往往分辨率不夠,而且有些微生物種類的rRNA基因序列相同或者非常接近,為了提高微生物種類鑒別率,另外一些保守或共同的基因組區(qū)域可用于檢測,多位點序列分析(MLST)檢測5~7個管家基因間450bp~500bp片段,大多數(shù)的細菌種類可通過MLST鑒別。
與真核生物一樣,細菌基因組DNA中也存在重復(fù)序列,許多細菌可通過檢測這些VNTR區(qū)域進行鑒別,如美國2001年炭疽信件攻擊事件中的炭疽孢子用多位點VNTR分析(MLVA),鑒定為艾姆斯張力菌株,該類菌株屬美國軍方實驗室使用。
MLVA根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物片段大小分型,擴增片段直接與DNA片段重復(fù)次數(shù)相關(guān),擴增產(chǎn)物通過電泳分型,現(xiàn)在一般采用毛細管電泳,自動化程度高。MLVA的局限性在于,因為該法檢測的是突變率較高的部位,因此,不適合于進化關(guān)系研究。
另一種用于微生物種屬鑒別的方法為單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析法,現(xiàn)在一般用美國ABI公司的ABI PRISM SNaPshot? 試劑盒,用這種試劑盒檢測速度快、穩(wěn)定性好、可自動化操作,電泳分型和熒光檢測所需技術(shù)在大多數(shù)實驗室都能完成。
雖然DNA檢驗在微生物鑒別方面已取得一定成果,但其分辨效率仍遠低于其他傳統(tǒng)物證檢驗,距偵查破案的實際需求仍有一定距離,還需要不斷地進行研究。一方面,應(yīng)建立新的更加快速的檢測微生物多態(tài)性的方法;另一方面,要做好基礎(chǔ)工作,建立完備的微生物DNA數(shù)據(jù)庫。
[1]R Breeze, B Budowle and S Schutzer. Microbial Forensics[M].Bur l ington: ElseVier Academic Press,2005.