王玉愛(ài) 劉志杰

β-防御素-2(hBD-2)是近年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)由中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的，富含半胱氨酸的陽(yáng)離子低分子肽類(lèi)，它先天性免疫中保護(hù)宿主免受多種病原微生物引起感染中起關(guān)鍵性作用，如革蘭陰性和陽(yáng)性細(xì)菌、酵母菌和一些有包膜病毒[1]。唾液支原體是一種與人類(lèi)牙周病密切相關(guān)的病原體[2]，目前hBD-2在抵抗唾液支原體感染中的作用還不是完全清楚。本研究試圖通過(guò)檢測(cè)hBD-2在上皮細(xì)胞中的表達(dá)以及是否對(duì)唾液支原體具有抗菌作用來(lái)探討其防御機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑與菌株

hBD-2購(gòu)自Merk。牙齦上皮細(xì)胞(HGEC)的制備按照有關(guān)參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行[3]，唾液支原體來(lái)自ATCC(ATCC 23064)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.2 抗菌活性檢測(cè)

唾液支原體(ATCC23064)于含有10%馬血清、1%酵母浸液，1%精氨酸、1000u青霉素的PPLO肉湯培養(yǎng)基(pH7.0)中培養(yǎng)。當(dāng)pH值上升一個(gè)單位，15000g離心15min，無(wú)菌PBS洗滌3次并用含有1%明膠的Hank’s液重懸浮。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

收集HGEC細(xì)胞，按5×104/孔接種至包被有Ⅰ型膠原的6孔板中。待其生長(zhǎng)2d后加入上述菌液(使用時(shí)稀釋10倍)混合培養(yǎng)培養(yǎng)。收集細(xì)胞在4℃1500g離心5分鐘得到沉淀。沉淀物用來(lái)提取RNA，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶XL和TaKaRa Ex Taq聚合酶依照說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行cDNA合成和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)(Takara)。人hBD-2和GAPDH(用做內(nèi)對(duì)照)的引物由上海生工合成，序列分別如下[4]：hBD-2：上游：5’-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3’，下游5’-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3’；GAPDH：上游：5’-GTC AAG GCT GAG AAC GGG AA-3’，下游5’-GCT TCA CCA CCT TCT TGA TG-3’。產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為254bp和613bp。具體反應(yīng)條件如下：94℃1min，63℃1min，72℃1min，共33個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳用溴化乙錠染色并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果

2.1 唾液支原體能誘導(dǎo)HGEC細(xì)胞表達(dá)hBD-2mRNA

圖1所示，唾液支原體感染后能誘導(dǎo)HGEC細(xì)胞表達(dá)hBD-2 mRNA。而β-actin的無(wú)明顯變化。

2.2 hBD-2的抗菌活性

hBD-2的抗菌活性如圖2所示，hBD-2在1～4μM呈劑量依賴(lài)性，在4μM濃度時(shí)，唾液支原體數(shù)量比對(duì)照物抑菌率達(dá)86%。

3 討論

由于長(zhǎng)期濫用抗菌藥物，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)界的一大難題。目前尋求天然抗菌活性藥物已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。hBD-2是一類(lèi)可誘導(dǎo)表達(dá)的人類(lèi)抗微生物多肽，正常情況下在皮膚、腎臟、鼻黏膜等組織中甚少表達(dá)，而在感染和炎癥狀態(tài)下才大量表達(dá)，本研究結(jié)果顯示，唾液支原體感染后，能誘導(dǎo)HGEC細(xì)胞表達(dá)hBD-2mRNA。抑菌結(jié)果可以看出，在4μM濃度時(shí)，對(duì)唾液支原體的抑制率將近達(dá)90%。以上結(jié)果說(shuō)明其在人體的防御體系中可能發(fā)揮著一定的作用：感染可明顯誘導(dǎo)或增強(qiáng)hBD-2的表達(dá)水平，hBD-2不僅可以直接抵抗病原微生物的感染，而且還可以通過(guò)啟動(dòng)獲得性免疫系統(tǒng)來(lái)提高機(jī)體抵抗微生物感染的免疫水平。

關(guān)于hBD-2抗微生物的機(jī)制主要是誘導(dǎo)微生物細(xì)胞膜上形成孔道而殺傷靶細(xì)菌。大多數(shù)原核生物胞膜帶負(fù)電荷，而正常的真核細(xì)胞由于細(xì)胞骨架系統(tǒng)高度發(fā)達(dá)，膽固醇含量較高，負(fù)電荷較少，因而不與hBD-2發(fā)生作用。此外，hBD-2的抗微生物活性還受到某些因素的影響，如環(huán)境中的鹽濃度和離子種類(lèi)等。由于hBD-2殺菌具有獨(dú)特性，不易耐藥，因此對(duì)它的研究及應(yīng)用已成為生物制藥領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，將對(duì)新疫苗的發(fā)展起到重要作用。

[1]Abiko Y,Saitoh M,Nishimura M,et al.Role of beta-defensins in oral epithelial health and disease[J].Med Mol Morphol.2007 Dec,40(4):179-184.

[2]Johnson SM,Bruckner F,Collins D.Distribution of Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma salivarium in the synovial fluid of arthritis patients[J].J Clin Microbiol,2007 Mar,45(3):953-957.

[3]Mahanonda R,Sa-Ard-Iam N,Eksomtramate M,et al.Cigarette smoke extract modulates human beta-defensin-2 and interleukin-8 expression in human gingival epithelial cells[J].J Periodontal Res,2009 Aug,44(4):557-564.

[4]Han JH,Kim MS,Lee MY,et al.Modulation of human betadefensin-2 expression by 17beta-estradiol and progesterone in vaginal epithelial cells[J].Cytokine,2009 Oct 8.

[5]Dann SM,Eckmann L.Innate immune defenses in the intestinal tract[J].Curr Opin Gastroenterol,2007 Mar,23(2):115-20.