劉 韓，關(guān) 宏，楊文欽，王慧榮，張 琪，劉吉成

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院微生態(tài)工程技術(shù)中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

雙歧桿菌（Bifidobacteria）是健康個(gè)體腸道中的優(yōu)勢菌，在人的一生中與人始終保持著共生關(guān)系。研究表明，雙歧桿菌具有調(diào)整腸道菌群[1-2]、防止便秘、降低結(jié)腸癌的發(fā)病率[3]、產(chǎn)生抗菌素[4]、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)[5]、緩解乳糖不耐癥以及降低膽固醇等功效[6]。由于在人類生理方面發(fā)揮的重要作用，雙歧桿菌現(xiàn)已成為商業(yè)上優(yōu)選的益生菌。其中青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentic）是青年個(gè)體腸道中的優(yōu)勢菌，對人體產(chǎn)生許多益生作用。但由于青春雙歧桿菌對氧非常敏感，對低pH的抵抗能力差，并對營養(yǎng)要求苛刻，在獲取高活菌數(shù)培養(yǎng)物時(shí)有一定困難。Annan等研究指出凝膠微球包囊法能夠改善青春雙歧桿菌暴露在胃腸道時(shí)的存活率[7]；許多研究報(bào)道添加蛋白胨、半胱氨酸、酵母浸出物、寡聚糖等營養(yǎng)物質(zhì)可以提高雙歧桿菌的活菌數(shù)[8-11]，但成本過高、操作繁瑣，不適合大規(guī)模生產(chǎn)使用。田寒友等曾對一株長雙歧桿菌進(jìn)行了工業(yè)化培養(yǎng)基的篩選[12]。然而，青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基方面的相關(guān)報(bào)道很少。本文篩選了幾種價(jià)格低廉的商業(yè)化產(chǎn)品作為青春雙歧桿菌生長所需碳源和氮源，篩選出了青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基成分。利用此培養(yǎng)基優(yōu)化了對青春雙歧桿菌活菌數(shù)的影響的接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間一系列生長條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

青春雙歧桿菌23001，現(xiàn)保藏于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院微生態(tài)工程技術(shù)推廣中心。

完達(dá)山脫脂乳粉，ALPAVIT乳清粉，葡萄糖，雙歧因子A（購自于江門量子高科生物有限公司）；雙歧因子B（購自于大慶日月星有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基中添加0.5%半胱氨酸），雙歧桿菌培養(yǎng)基0233，10%脫脂乳培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SHEL LAB公司厭氧培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司高壓蒸汽滅菌器，梅特勒-托利多pH計(jì)，奧林巴斯電子顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化

在厭氧條件下，利用雙歧桿菌培養(yǎng)基0233對青春雙歧桿菌凍干粉進(jìn)行復(fù)蘇，37℃厭氧培養(yǎng)48 h；按5%（V/V）的接種量接種到10%脫脂乳中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h。菌種放置在4℃冰箱保存，每次試驗(yàn)前活化1次。

1.2.2 活菌數(shù)的測定

菌落總數(shù)按GB/T 4789.2-2003規(guī)定的平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行測定。菌液以10倍梯度稀釋，用改良MRS培養(yǎng)基傾注到稀釋液平皿中，37℃厭氧培養(yǎng)72 h。

1.2.3 菌液pH值的測定

利用pH計(jì)測定。

1.2.4 青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基成分的篩選

以雙歧因子A、葡萄糖、乳清粉、雙歧因子B、脫脂乳這幾種價(jià)格低廉的商業(yè)化產(chǎn)品作為培養(yǎng)基成分，每次選擇其中一個(gè)因素做單因素試驗(yàn)，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.4.1 雙歧因子A含量的確定

以 8%（W/V）脫脂乳、1%（W/V）雙歧因子 B、1%（W/V）乳清粉和1%（W/V）葡萄糖為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0、0.5%、1%和2%（W/V）的雙歧因子A，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)、pH值。

1.2.4.2 葡萄糖含量的確定

以8%脫脂乳、1%雙歧因子A、1%乳清粉和1%雙歧因子B為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0、0.5%、1%和2%的葡萄糖，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.4.3 乳清粉含量的確定

以8%脫脂乳、1%雙歧因子A和1%雙歧因子B為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0、0.5%、1%和2%的乳清粉，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.4.4 雙歧因子B含量的確定

以8%脫脂乳、1%雙歧因子A為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0、0.5%、1%和2%的雙歧因子B，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.4.5 脫脂乳含量的確定

以1%雙歧因子A、1%雙歧因子B為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加4%、6%、8%和10%的脫脂乳，5%接種，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.5 生長條件的優(yōu)化

1.2.5.1 最佳接種量的確定

在篩選出的工業(yè)化培養(yǎng)基中分別接種1%、3%、5%和7%（V/V）的菌種（菌種活菌數(shù)為6.5×108cfu·mL-1），37℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.5.2 最佳培養(yǎng)溫度的確定

在篩選出的工業(yè)化培養(yǎng)基中接種1%的菌種，分別在37、39和42℃厭氧培養(yǎng)24 h，測定發(fā)酵液活菌數(shù)及pH值。

1.2.5.3 生長曲線的測定及pH變化

1%接種量接種于篩選出的工業(yè)化培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)，分別于第0、3、6、9、12、15、21和24 h取樣測定發(fā)酵液活菌數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)菌數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線，同時(shí)測定培養(yǎng)基pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧因子A含量對青春雙歧桿菌影響

由圖1可知，未添加雙歧因子A的培養(yǎng)基中青春雙歧桿菌活菌數(shù)小于107cfu·mL-1，pH 5.227。而添加不同濃度雙歧因子A的培養(yǎng)基中青春雙歧桿菌活菌數(shù)都大于108cfu·mL-1，pH差異不大（4.090～4.167）?？梢婋p歧因子A的存在對青春雙歧桿菌的生長有明顯的促進(jìn)作用。此外，當(dāng)雙歧因子A添加量為1%時(shí)，青春雙歧桿菌活菌數(shù)最高為6.55×108cfu·mL-1。因此，選擇雙歧因子A添加量為1%。

圖1 雙歧因子A含量對青春雙歧桿菌影響Fig.1 Effect of Bifidobacterium factor A on the growth of B.adolescentic

2.2 葡萄糖含量對青春雙歧桿菌影響

由圖2可知，添加不同含量的葡萄糖對青春雙歧桿菌活菌數(shù)及pH沒有明顯的影響，這與文獻(xiàn)報(bào)道添加葡萄糖對雙歧桿菌生長有促進(jìn)作用的結(jié)論不一致[13]，原因可能是由于當(dāng)培養(yǎng)基中添加一定濃度雙歧因子A后掩蓋了葡萄糖對青春雙歧桿菌生長的促進(jìn)作用。從降低生產(chǎn)成本和提高青春雙歧桿菌活菌數(shù)兩方面綜合考慮，選擇葡萄糖添加量為0。

2.3 乳清粉含量對青春雙歧桿菌影響

由圖3可知，在含有8%脫脂乳、1%雙歧因子A和1%雙歧因子B的培養(yǎng)基中添加不同濃度的乳清粉對青春雙歧桿菌生長沒有明顯的影響。從降低生產(chǎn)成本和提高青春雙歧桿菌活菌數(shù)兩方面綜合考慮，選擇乳清粉添加量為0。

圖2 葡萄糖含量對青春雙歧桿菌影響Fig.2 Effect of contents of glucose on B.adolescentic

圖3 乳清粉含量對青春雙歧桿菌影響Fig.3 Effect of contents of whey powder on B.adolescentic

2.4 雙歧因子B對青春雙歧桿菌影響

由圖4可知，在添加不同濃度的雙歧因子B的培養(yǎng)基中，青春雙歧桿菌活菌數(shù)均大于108cfu·mL-1，pH無明顯差異。此外，當(dāng)雙歧因子B添加量為1%時(shí)，青春雙歧桿菌活菌數(shù)相對較高為4.4×108cfu·mL-1。因此，選擇雙歧因子B添加量為1%。

圖4 雙歧因子B含量對青春雙歧桿菌影響Fig.4 Effect of Bifidobacterium factor B on B.adolescentic

2.5 脫脂乳含量對青春雙歧桿菌影響

由圖5可知，培養(yǎng)基中脫脂乳含量為4%時(shí)，青春雙歧桿菌活菌數(shù)為6.6×107cfu·mL-1，而脫脂乳含量為6%以上時(shí)，青春雙歧桿菌活菌數(shù)均為108cfu·mL-1以上；不同發(fā)酵液的pH差異不大。由此可以看出，培養(yǎng)基中含有1%雙歧因子A和1%雙歧因子B的同時(shí)，只有當(dāng)脫脂乳含量在6%以上時(shí)才能保障青春雙歧桿菌生長充足的氮源和碳源。脫脂乳含量為6%和8%的發(fā)酵液中青春雙歧桿菌活菌數(shù)差異不大，由于脫脂乳含量為8%的發(fā)酵液狀態(tài)明顯優(yōu)于6%的發(fā)酵液，因此，青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基選擇脫脂乳含量為8%。

圖5 脫脂乳含量對青春雙歧桿菌影響Fig.5 Effect of contents of skim milk on B.adolescentic

2.6 最佳接種量的確定

由圖6可知，接種量為1%、3%和5%（V/V）時(shí)，發(fā)酵液中青春雙歧桿菌活菌數(shù)及pH基本一致，當(dāng)接種量為7%時(shí)，發(fā)酵液中青春雙歧桿菌活菌數(shù)有所下降。因此，選擇最佳接種量為1%（6.5×106cfu·mL-1）。

圖6 接種量對青春雙歧桿菌影響Fig.6 Effect of inoculation amount on B.adolescentic

2.7 最佳培養(yǎng)溫度的確定

由圖7可知，發(fā)酵液中青春雙歧桿菌活菌數(shù)隨培養(yǎng)溫度的升高而降低，青春雙歧桿菌在37℃生長最旺盛，與先前的研究結(jié)論一致[8]，因此，選擇37℃做為青春雙歧桿菌的最佳培養(yǎng)溫度。此外，由于青春雙歧桿菌在39和42℃培養(yǎng)時(shí)活菌數(shù)也在可以接受的范圍內(nèi)（>108cfu·mL-1），因此，在特殊的生產(chǎn)工藝中也可將青春雙歧桿菌的培養(yǎng)溫度適度提高。

圖7 培養(yǎng)溫度對青春雙歧桿菌影響Fig.7 Effect of temperature on B.adolescenti

2.8 青春雙歧桿菌在工業(yè)化培養(yǎng)基中的生長特性

由圖8可知，青春雙歧桿菌在此培養(yǎng)基中的對數(shù)生長期為3～9 h，37℃厭氧培養(yǎng)9 h時(shí)，青春雙歧桿菌活菌數(shù)達(dá)到最高1.16×109cfu·mL-1。

3 討 論

雙歧桿菌對營養(yǎng)要求苛刻，培養(yǎng)基中除了含有細(xì)菌生長所必需的碳源和氮源外，還必須含有豐富的氨基酸、維生素和糖類等物質(zhì)。Chou等研究了長雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌在添加酵母粉、蛋白胨等營養(yǎng)物質(zhì)的豆乳中的生長特性[13]。杜鵬等研究了嬰兒雙歧桿菌在添加蛋白胨、酵母粉、胡蘿卜汁和低聚糖等營養(yǎng)物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基的生長特性[10]。孟祥晨等采用正交試驗(yàn)優(yōu)化了青春雙歧桿菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基及增殖因子的用量，得到了青春雙歧桿菌增菌培養(yǎng)基[8]。但上述培養(yǎng)基成分復(fù)雜、操作繁瑣、成本較高不適宜大規(guī)模生產(chǎn)，此外雙歧桿菌對氧氣十分敏感，在培養(yǎng)以及保存時(shí)受到一定的限制。

本研究確定的青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基解決了青春雙歧桿菌培養(yǎng)困難、生產(chǎn)成本高和不適合規(guī)?；a(chǎn)的問題。有關(guān)菌液濃縮及凍干條件還需進(jìn)一步考察，將菌液制成高活菌數(shù)的凍干菌粉，解決保存困難的問題。

4 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)確定青春雙歧桿菌工業(yè)化培養(yǎng)基成分為：脫脂乳8%（W/V）、雙歧因子A 1%（W/V）、雙歧因子B 1%（W/V）。利用上述培養(yǎng)基，確定了青春雙歧桿菌的最佳接種量為1%（V/V）、最佳培養(yǎng)溫度為37℃。在此條件下，測定了青春雙歧桿菌的生長曲線和pH值變化，在37℃厭氧條件下培養(yǎng)時(shí)間9 h為最佳生長條件，此時(shí)青春雙歧桿菌活菌數(shù)最高可達(dá)1.16×109cfu·mL-1。雙歧因子A的存在對青春雙歧桿菌的生長有明顯促進(jìn)作用。

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