朱春紅，吳 娟，張偉娟，陸光富，朱國強*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009；2.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學院，江蘇泰州225300)

腸炎沙門氏菌是目前引起人類食物中毒的主要病原之一[1]，其感染主要是因食用了被腸炎沙門氏菌污染的動物性食品，尤其是家禽的肉蛋食品，因而對該菌的研究倍受國內(nèi)外學者的關(guān)注[2]。

腸炎沙門氏菌能表達多種菌毛結(jié)構(gòu)，主要包括：SEF14，SEF17，SEF21，長極性菌毛(LPF)，質(zhì)粒編碼菌毛(PEF)等。其中SEF14是90年代鑒定出來的一種菌毛[3]，沒有凝集紅細胞的能力，其編碼基因僅分布于血清D群沙門氏菌中，目前僅在腸炎沙門氏菌和都柏林沙門氏菌中檢測到SEF14菌毛的表達，而某些D群沙門氏菌如雞沙門氏菌，雞白痢沙門氏菌和傷寒沙門氏菌均具有完整的sef基因操縱子，但卻不能表達SEF14菌毛，這是很少見的現(xiàn)象[4]。

完整的sef基因操縱子至少由 sefA，sefB，sefC，sefD4個基因組成[5]，其中sefA編碼SEF14菌毛的主要亞單位蛋白，sefB編碼伴侶蛋白亞單位，和大腸桿菌菌毛的外周伴侶蛋白類似，sefC則編碼推進蛋白，這種蛋白位于外膜中，負責將菌毛亞單位組織和裝配到聚合的菌毛結(jié)構(gòu)上，sefD基因作為sef基因操縱子的組成部分，可能編碼SEF14菌毛的頂端結(jié)構(gòu)，并在致病過程中起著重要的作用[6]。目前關(guān)于SEF14菌毛的功能，有報道認為SEF14菌毛介導了腸炎沙門氏菌在腸道的定植，但也有報道其與黏附與定植功能無關(guān)，但有助于腸炎沙門氏菌在巨噬細胞中的存活，并影響入侵細胞的相關(guān)細胞因子的表達，增強腸炎沙門氏菌的毒力[7]。

腸炎沙門氏菌與雞白痢沙門氏菌引起雞群發(fā)病的癥狀和病理學變化非常相似，所以在臨床感染中往往把雞腸炎沙門氏菌感染誤診為雞白痢或傷寒。腸炎沙門氏菌宿主譜比雞白痢沙門氏菌廣泛，而血清學診斷的敏感度低，因此該病的防治和普查要比雞白痢困難得多。兩種表達SEF14菌毛的沙門氏菌，只有腸炎沙門氏菌在家禽中較為流行，而都柏林沙門氏菌在家禽中的感染鮮見報道。本實驗構(gòu)建重組菌體外表達SEF14菌毛主要亞單位SEFA蛋白，檢測重組蛋白的免疫原性和反應原性，并建立間接ELISA方法檢測腸炎沙門氏菌感染血清，為臨床檢測腸炎沙門氏菌的感染和血清學調(diào)查奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒 腸炎沙門氏菌國內(nèi)標準株CMCC(B)50336由本校焦新安教授提供，雞白痢沙門氏菌標準株、都柏林沙門氏菌標準株、鼠傷寒沙門氏菌標準株、E.coliBL21(DE3)、DH5α均由本實驗室保存。pET22b+質(zhì)粒購自Invitrogen公司；腸炎沙門氏菌國內(nèi)標準株CMCC(B)50336小鼠感染陽性血清由本實驗室制備。

1.2 主要試劑 TaqDNA聚合酶，DNA凝膠回收試劑盒，λHindⅢDNA Marker、DNA Marker DL2000、Miniprep質(zhì)粒提取試劑盒、pMD18-T質(zhì)粒和標準低分子量蛋白Marker購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自NEB公司。羊抗鼠IgG-HRP、羊抗雞IgG-HRP、DAB均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 實驗動物 ICR品系青年小白鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心實驗動物房。

1.4 sefA基因的擴增和鑒定 根據(jù)已發(fā)表的sefA基因序列(L11008)，用DNAStar軟件分析設(shè)計一對引物，引物序列為：NdeⅠ-sefAF:CGCATATGGCTGG CTTTGTTGGTAAC；NotⅠ-sefAR:CGGCGGCCGCT TAGTTTTGATACTGCTGAA。按全菌裂解法制備國內(nèi)標準株CMCC(B)50336模板DNA[9]。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定后，克隆于pMD18-T，通過氨芐抗性和藍白斑篩選所獲陽性克隆重組質(zhì)粒pMD18-sefA，經(jīng)測序引物M13-47測序鑒定。

1.5 sefA基因的克隆和鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖切膠回收，以及雙酶切消化后克隆于表達載體pET22b+，通過氨芐抗性篩選結(jié)合酶切分析鑒定出重組pET-sefA質(zhì)粒的陽性克隆。

1.6 重組菌的誘導表達、純化以及重組蛋白的鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，根據(jù)pET表達系統(tǒng)操作手冊優(yōu)化重組蛋白誘導條件，并用Novagen公司的固定化鎳離子親和層析試劑盒純化重組蛋白。純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，以BIO-RAD轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將凝膠中蛋白條帶電轉(zhuǎn)移到NC膜上，10%BSA 4℃封閉過夜。PBST洗滌NC膜后依次加入1∶1000稀釋的抗His-Tag的單克隆抗體，1∶500稀釋的羊抗鼠IgG-HRP孵育，DAB底物顯色。

1.7 腸炎沙門氏菌SEF14菌毛提取以及重組蛋白的免疫原性鑒定 根據(jù)已報道的方法提取腸炎沙門氏菌標準株CMCC(B)50336 SEF14菌毛[8]。將純化的重組蛋白按常規(guī)方法免疫ICR小鼠，三免后第10 d麻痹小鼠眼球采血分離血清，經(jīng)間接ELISA方法檢測陽性備用。利用該血清和腸炎沙門氏菌國內(nèi)標準株CMCC(B)50336小鼠感染陽性血清，通過western blot檢測重組蛋白的免疫原性。

1.8 間接ELISA程序的建立 取96孔ELISA板，重組抗原用pH9.6的碳酸鹽緩沖液依次做1∶50、1∶100至1∶3200倍比稀釋,每孔100 μL，37℃作用3 h后4℃過夜包被。次日取出后洗滌5遍。封閉后將陽性血清和陰性血清按1∶20至1∶1280倍比稀釋，自上而下分別加入反應孔中，37℃作用1 h，洗滌。加入IgG-HRP的作為二抗，37℃作用1 h，洗滌，加含OPD底物顯色液，37℃避光作用20 min～30 min；以2 mol/L H2SO4終止反應，觀察結(jié)果，測量OD490nm值。上述操作重復3次。選取最佳的重組蛋白抗原包被濃度和血清稀釋度。

1.9 間接ELISA方法臨界值的確定 用建立的間接ELISA方法對10份SPF雞陰性血清(糞便棉拭檢測無腸炎沙門氏菌感染)進行檢測，測定其OD490nm值并計算OD490nm值平均值χ和標準差(SD)。將10份陰性血清OD490nm值平均值+3SD定為陰、陽性血清臨界值，當待測樣本的OD490nm值≥上述臨界值時，判其為陽性。

1.10 間接ELISA特異性以及臨床檢測 腸炎沙門氏菌，雞白痢沙門氏菌，都柏林沙門氏菌，鼠傷寒沙門氏菌標準株小劑量(100 cfu/只)接種小鼠(各10只)制得各自的鼠抗血清，用上述建立的間接ELISA方法檢測其抗體及其特異性。從無錫某雞場隨機采集家禽血清100份，使用建立的ELISA程序初步檢測雞場腸炎沙門氏菌的感染情況。

2 結(jié)果

2.1 sefA基因的PCR擴增、鑒定 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，利用設(shè)計的引物以腸炎沙門氏菌國內(nèi)標準株CMCC(B)50336基因組DNA為模板成功地擴增出特異性目的條帶，其片段大小與預期設(shè)計的498 bp相符。將該PCR片段克隆到pMD18-T質(zhì)粒，經(jīng)測序引物M13-47測序證明，該sefA基因DNA序列與已發(fā)表的sefA序列一致。

2.2 sefA基因的表達以及鑒定 將上述sefA基因克隆到pET22b+中構(gòu)建pET-sefA重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒單酶切產(chǎn)物大小為5991 bp，而雙酶切產(chǎn)物大小分別約為5500 bp和500 bp，與預期大小相符。SDSPAGE結(jié)果表明重組蛋白rSEFA約15.2 ku(圖1)，根據(jù)重組菌在不同溫度(29℃和37℃)以及不同IPTG濃度條件下的表達量差異得出其最佳誘導條件為：IPTG終濃度為0.4 mmol/L，37℃誘導3 h。使用鼠抗His-Tag的單克隆抗體進行western blot檢測，在相對分子量為15.2 ku處有特異性條帶，表明純化產(chǎn)物為含His標簽的重組蛋白rSEFA(圖2)。

2.3 重組蛋白western blot檢測 提取腸炎沙門氏菌SEF14菌毛，獲取大小為14 ku左右與重組蛋白rSEFA分子量相近的主要亞單位蛋白，3次重復結(jié)果一致，表明腸炎沙門氏菌能表達SEF14菌毛(圖3A)。上述提純的SEF14菌毛以及純化的重組蛋白rSEFA經(jīng)SDS-PAGE之后，用重組蛋白rSEFA免疫小鼠所得多抗血清和標準株CMCC(B)50336感染陽性血清進行western blot檢測(圖3B和圖3C)，表明重組蛋白rSEFA免疫得到的高免血清能識別從國內(nèi)標準株CMCC(B)50336中提取的SEF14菌毛蛋白；所純化的重組蛋白rSEFA也能被標準株CMCC(B)50336感染陽性血清識別，重組蛋白rSEFA和上述菌毛蛋白具有同樣的免疫原性、反應原性，可作為檢測抗原使用。

2.4 間接ELISA抗原、血清的最佳工作濃度的確定 根據(jù)方陣ELISA測試結(jié)果，選擇了最佳的抗原和血清稀釋倍數(shù)(抗原的最佳濃度為7.5 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶20)。當重組抗原rSEFA每孔包被量為0.75 μg、血清稀釋倍數(shù)為1∶20時，陽性血清的OD490nm值在1.0左右，而且陰性值較低，平均值為 0.192，陽性樣品 OD490nm值 /陰性對照平均值(P/N)達到 4.864。

2.5 間接ELISA方法臨界值的確定 用建立的間接ELISA方法檢測10份SPF雞陰性血清，并測定其OD490nm值。其OD值中最小值為0.223，最大值為0.539，標準差為0.06，經(jīng)計算得出OD490nm平均值+3SD為0.522，故本試驗間接ELISA方法的判定值定為0.522。

2.6 特異性試驗以及臨床檢測 建立的間接ELISA檢測腸炎沙門氏菌、都柏林沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌感染血清，OD490nm平均值分別為1.212、0.990和0.505，說明此方法能特異性識別腸炎和都柏林沙門氏菌感染血清，OD平均值均高于臨界值，而不能識別雞白痢沙門氏菌感染血清，其OD平均值低于臨界值，此檢測方法特異性良好。根據(jù)已建立的ELISA方法檢測無錫某雞場的100份血清，抗體陽性率高達67%，以此可以推測在國內(nèi)某些養(yǎng)雞場，腸炎沙門氏菌的隱性感染比較嚴重的，需要加強管理和防范。

3 討論

本實驗利用PCR技術(shù)以腸炎沙門氏菌國內(nèi)標準株CMCC(B)50336基因組DNA為模板成功擴增出編碼SEF14菌毛操縱子亞單位sefA基因，將其克隆入表達載體pET22b+，鑒定和篩選出含sefA基因正確閱讀框架的pET-sefA重組質(zhì)粒，進一步轉(zhuǎn)化進誘導表達系統(tǒng)E.coliBL21(DE3)，優(yōu)化誘導表達條件獲得rSEFA蛋白表達，用該重組蛋白制備的鼠抗高免血清抗體能識別從標準株CMCC(B)50336中提純的SEF14菌毛，同時這一重組蛋白能被標準株CMCC(B)50336的感染陽性血清識別，上述結(jié)果表明，原核表達的rSEFA蛋白與標準蛋白具有同樣的免疫原性和反應原性。

目前，在家禽生產(chǎn)過程中腸炎和雞白痢沙門氏菌的感染比較普遍，但關(guān)于都柏林沙門氏菌的感染卻鮮見報道。國外相關(guān)研究表明，脂質(zhì)體SEF14菌毛抗原滴眼免疫小鼠，能誘導小鼠腸道黏膜和全身的體液免疫，產(chǎn)生IgG和IgA，明顯降低腸道中腸炎沙門氏菌的定植和糞便中的帶菌率[10]。另有相關(guān)報道稱，家禽感染腸炎沙門氏菌后兩周內(nèi)，88%的抗血清能與重組蛋白SEFA產(chǎn)生反應，而在隨后的時間內(nèi)，則100%能產(chǎn)生反應[11]。本實驗構(gòu)建重組菌，體外表達SEF14菌毛主要亞單位蛋白SEFA，并初步建立間接ELISA方法檢測家禽中腸炎沙門氏菌的抗體情況。通過ELISA方陣確定了間接ELISA方法的2個參數(shù)，即抗原包被量和血清稀釋倍數(shù)，并對此方法進行了特異性檢測，結(jié)果表明，該方法特異性良好。因此，可以推測腸炎沙門氏菌在小鼠體內(nèi)能表達SEF14菌毛，并產(chǎn)生可供檢測的抗體。本實驗用建立的間接ELISA方法對無錫某雞場100份血清樣品進行檢測，初步結(jié)果顯示抗體陽性率高達67%。

迄今為止，在全球范圍內(nèi)家禽的腸炎沙門氏菌的隱性感染是一個很嚴重的問題，每年由此引發(fā)的食物中毒事件，或者由此引起的間接經(jīng)濟損失巨大，如何有效預防和控制家禽養(yǎng)殖過程中腸炎沙門氏菌的感染仍然是個急待解決的問題。上述研究一方面為深入研究腸炎沙門氏菌SEF14菌毛在易感宿主體內(nèi)的致病作用提供了很好的基礎(chǔ)；另一方面表明基于重組蛋白rSEFA建立的間接ELISA檢測方法，其特異性較好，可以初步應用于家禽生產(chǎn)中腸炎沙門氏菌抗體的檢測，進行相關(guān)血清學調(diào)查，為有效防制腸炎沙門氏菌感染提供可行的診斷方法和檢測標準，進一步為凈化種群奠定基礎(chǔ)。

[1]Gantois I.Ducatelle R,Pasmans F et al.Salmonella enterica serovarEnteritidis genes induced during oviduct colonization and egg contamination in laying hens[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(21):6616-6622.

[2]Ukuku D O,Jin T,Zhang H.Membrane damage and viability loss ofEscherichia coliK-12 andSalmonellaenteritidis in liquid egg by thermal death time disk treatment[J].J Food Prot,2008,71(10):1988-1995.

[3]Thorns C J,Sojka M G,Chasey D.Detection of a novel fimbrial structure on the surface ofSalmonellaenteritidis by using a monoclonal antibody[J].J Clin Microbiol,1990,28:2409-2414.

[4]Walker S L,Sojka M,Dibb-Fuller M,et al.Effect of pH,temperature and surface contact on the elaboration offimbriaeandflagellabySalmonellaserotype Enteritidis[J].J Med Microbiol,1999,48(3):253-261.

[5]Clouthier S C,Müller K H,Doran J L,et al.Characterization of three fimbrial genes,sefABC,ofSalmonellaenteritidis[J].J Bacteriol,1993,175(9):2523-2533.

[6]Clouthier S C,Collinson S K,Kav W W.Unique fimbriae-like structures encoded by sefD of the SEF14 fimbrial gene cluster of Salmonellaenteritidis[J].Mol Mocrobiol,1994,12(6):893-901.[7]Edward R A,Schifferli D M,Maloy S R.A role forSalmonella fimbriaein intraperitoneal infections[J].Proc Natl Acad Sci,2000,97(3):1258-1262.

[8]Feutrier J,Kay W W,Trust T J.Purification and characterization offimbriaefromSalmonellaenteritidis[J].J Bacteriol,1986,168(1):221-227.

[9]薩姆布魯克，弗里奇，曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南[M].2版.北京：科學出版社，1992.

[10]Li W,Watarai S,Iwasaki T,et al.Suppression ofSalmonella entericaserovar Enteritidis excretion by intraocular vaccination with fimbriae proteins incorporated in liposomes[J].Dev Comp Immunol,2004,28(1):29-38.

[11]Rajashekara G,Munir S,Lamichhane C M,et al.Application of recombinantfimbrialprotein forthe specific detection of Salmonellaenteritidis infection in poultry[J].Diagn Microbiol Infect Dis 1998,32(3):147-157.