祁 宏,苗永旺＊,2

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201;2.云南大學(xué)云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650091)

κ酪蛋白是最重要的酪蛋白之一,它不僅在酪蛋白微團(tuán)的穩(wěn)定性方面起至關(guān)重要的作用,而且對(duì)奶牛泌乳性能及乳成分組成和奶酪品質(zhì)均有一定程度的影響。牛κ酪蛋白由169個(gè)氨基酸殘基組成,其編碼基因從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)算起有近13 kb,由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。牛κ酪蛋白共發(fā)現(xiàn)有11種變異體,均由核苷酸非同義替換造成。許多研究結(jié)果表明,牛κ酪蛋白基因可能會(huì)影響乳牛的產(chǎn)奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率,而且對(duì)牛乳的凝固特性和奶酪產(chǎn)量有顯著影響。牛κ酪蛋白變異體之間對(duì)奶酪生產(chǎn)的影響可能是由編碼序列的多態(tài)性引起的,而泌乳性狀與κ酪蛋白基因型之間的關(guān)系可以用基因調(diào)控區(qū)存在突變來(lái)解釋。

牛乳中含有大量蛋白質(zhì),其中酪蛋白約占牛乳總蛋白的80%[1]。κ酪蛋白是最重要的酪蛋白之一。牛κ酪蛋白(kappa-casein,κ-CN,CSN3)家族的參比蛋白是κ-CN A-1P,其 ExPASy登錄名為CASK Bovin,登錄號(hào)為P02668。它由169個(gè)氨基酸殘基組成 ,富含 Pro、Gln、Thr、Ala等氨基酸,分子量為19 037,其信號(hào)肽由 21個(gè)氨基酸殘基組成[2]。凝乳酶可水解κ-CN 105和106位點(diǎn)之間的肽鍵,其產(chǎn)物為側(cè)κ酪蛋白和巨肽[3],此反應(yīng)可使牛乳凝固[4]。側(cè)κ酪蛋白是疏水的,而巨肽是親水的。κ-CN的疏水部分與牛乳中三種鈣敏感酪蛋白(α s1,α s2,β酪蛋白)結(jié)合,而親水部分則暴露在牛乳酪蛋白微團(tuán)的外面。正是這種兩性電解質(zhì)的特性,使得κ-CN在形成酪蛋白微團(tuán)的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。同時(shí),也正是由于具有這一重要的功能,此水解位點(diǎn)及κ-CN在進(jìn)化上相對(duì)比較保守[5]。κ-CN不僅在酪蛋白微團(tuán)的穩(wěn)定性方面起至關(guān)重要的作用,而且對(duì)奶牛泌乳性能及乳成分組成和奶酪品質(zhì)均有一定程度的影響。但是這些方面的研究結(jié)果不盡一致,而且對(duì)它們的作用機(jī)理尚無(wú)深入研究。

1 κ酪蛋白的基因結(jié)構(gòu)

牛κ酪蛋白基因(CSN3)的cDNA序列和核苷酸全序列分別于 1984年和 1988年被公布。牛CSN3的開(kāi)放閱讀框包含573個(gè)核苷酸[6]。CSN3從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)算起有近13 kb,由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。第 1外顯子由5′非翻譯區(qū)(Untranslated Region,UT R)的65個(gè)核苷酸構(gòu)成,第2外顯子包含5′-UTR的后5個(gè)核苷酸并且編碼前導(dǎo)肽氨基酸的前19個(gè)氨基酸,第3外顯子僅有33個(gè)核苷酸,第4外顯子除編碼成熟蛋白質(zhì)中剩余的氨基酸外還包括3′-UTR的37個(gè)核苷酸,剩余的173個(gè)核苷酸在第5外顯子之中。CSN3各內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為2.5 kb,5.8 kb,2.0 kb和1.8 kb。在其第2和第3內(nèi)含子中有7個(gè)偶蹄獸Alu樣重復(fù)序列A家族序列和1個(gè)C家族序列。與這些重復(fù)序列和外顯子相比,內(nèi)含子的其余部分富含AT。CSN3 5′側(cè)翼序列包含TATA框和CAAT框,在-54開(kāi)始的區(qū)域內(nèi)存在與轉(zhuǎn)錄因子AP-1(Activator Protein l)識(shí)別序列相似的序列,在第4外顯子上游區(qū)也有其它可能的調(diào)控序列[7]。

2 κ酪蛋白的基因多態(tài)性

Farrell等(2004)在牛乳蛋白多態(tài)性命名的最新修訂版中提出,牛屬動(dòng)物的κ酪蛋白共發(fā)現(xiàn)有11種變異體[2],各變異體名稱及其在蛋白質(zhì)和DNA上的對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)表1。κ-CN最常見(jiàn)的兩個(gè)遺傳變異體是A和B,它們?cè)?36和148位氨基酸有差別,A的兩位點(diǎn)分別為Thr和Asp,而B(niǎo)為Ile和Ala[8],相應(yīng)的核苷酸替換分別為ACC※ATC和GAT※GCT。C變異體于1979年被 Di Stasio發(fā)現(xiàn),E變異體于1989年被 Erhardt發(fā)現(xiàn)[9]。Miranda等[10]指出C的97位為His,E的155位為Gly,而A在這兩位點(diǎn)分別為Arg和Ser,相應(yīng)的核苷酸替換分別為CGT※CAT和AGC※GGC。Seibert等[11]通過(guò)對(duì)脫脂牛乳進(jìn)行等電聚焦(Isoelectric Focusing,IEF),發(fā)現(xiàn)了κ-CN D,但后來(lái)經(jīng)證實(shí)其為κ-CN C。這提醒人們要鑒定所有的κ-CN變異體光靠電泳技術(shù)是不夠的,需要測(cè)定其氨基酸序列或編碼基因核苷酸序列才能正確區(qū)分所有的變異體,后來(lái)的變異體多是采用PCR技術(shù)結(jié)合其它技術(shù)發(fā)現(xiàn)的。1992年Sulimova等在瘤牛中發(fā)現(xiàn)F1變異體,它的148位氨基酸為Val[2]。Erhardt[9]通過(guò)IEF和堿性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE)在Pinzgauer牛中發(fā)現(xiàn)G1變異體。隨后Prinzenberg等[12]用 PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)技術(shù)把 CSN3F2和CSN3G1與其它變異體區(qū)別開(kāi)來(lái)。測(cè)序結(jié)果表明,CSN3F2存在的突變位點(diǎn)為G10530A,CSN3G1存在的突變位點(diǎn)為C10790T;由此推測(cè)CSN3F2的第10位氨基酸由Arg變?yōu)镠is,CSN3G1的第97位氨基酸由Arg變?yōu)镃ys。Sulimova等[13]通過(guò)相同方法在牦牛和歐洲野牛群中發(fā)現(xiàn)CSN3G2,其與A的區(qū)別在于它的148位氨基酸為Ala,其核苷酸替換為GAT※GCT。Prinzenberg等[14]通過(guò)高分辨率SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)法鑒定了新的多態(tài)體H和I,經(jīng)測(cè)序推導(dǎo)出的氨基酸序列顯示,H的135位為Ile,I的104位為Ala,其相應(yīng)的核苷酸替換分別為ACC※ATC和TCA※GCA。Mahé等[15]從非洲的 Baoulé牛中發(fā)現(xiàn)了 κ-CN J變異體,它與B變異體的差別在于其155位氨基酸為Arg,而B(niǎo)為Ser。由上可知,κ-CN的變異體都是由非同義核苷酸替換造成,而不存在缺失或插入的情況,核苷酸非同義替換導(dǎo)致了編碼氨基酸的改變。

表1 已發(fā)現(xiàn)的牛κ酪蛋白變異體

3 κ酪蛋白基因多態(tài)性與奶用性狀的相關(guān)性

自發(fā)現(xiàn)牛κ酪蛋白有遺傳變異體以來(lái),各國(guó)學(xué)者就一直試圖尋找其基因型和生產(chǎn)性狀之間的聯(lián)系。牛CSN3第4外顯子因編碼約94%的成熟蛋白質(zhì),而成為眾多學(xué)者研究的焦點(diǎn)。其與泌乳性能及乳成分組成之間的關(guān)聯(lián)性研究,多采用 PCRRFLP技術(shù)分型并結(jié)合統(tǒng)計(jì)模型分析的方法。已有的關(guān)于其基因分型及不同基因型對(duì)相關(guān)性狀影響的研究結(jié)果見(jiàn)表2。趙春江等[16]認(rèn)為乳蛋白基因位點(diǎn)效應(yīng)對(duì)產(chǎn)奶量的影響不顯著,且CSN3與乳成份沒(méi)有顯著相關(guān)。Lara等[17]發(fā)現(xiàn)κ-CN基因型對(duì)產(chǎn)奶量和乳蛋白率都有顯著影響,BB型比AA型產(chǎn)奶量少173 kg,但乳蛋白率比AA型高0.08%,而且CSN3對(duì)乳脂率的影響不顯著,但影響乳脂量。Alipanah等[18]在俄羅斯牛種中發(fā)現(xiàn)κ-CN BB型比AA型和AB型有更高的乳蛋白率,并指出將CSN3作為遺傳標(biāo)記納入選種方案可以顯著地改善牛群的乳品特征。Rachagani等[19]對(duì) 252頭印度Sahiwal牛的研究表明,κ-CN BB型有更高的產(chǎn)奶量、非脂肪固形物產(chǎn)量和乳蛋白量。鞠志花[20]等結(jié)合測(cè)序結(jié)果采用PCR-RFLP檢測(cè)了CSN3的多態(tài)性,提出在中國(guó)荷斯坦奶牛群體中,κ-CN B等位基因可作為改良奶牛乳脂率性狀的分子遺傳標(biāo)記。本文作者用酶切軟件分析了GenBank中具有代表性的兩條序列AY380228(A等位基因)和 AY380229(B等位基因),發(fā)現(xiàn)TaqⅠ是針對(duì)引起136位氨基酸變異的核苷酸突變的,HidⅢ和HinfⅠ是針對(duì)引起148位氨基酸變異的核苷酸突變的,而PstⅠ是針對(duì)編碼168位Ala的核苷酸同義突變位點(diǎn);并且發(fā)現(xiàn)3個(gè)位點(diǎn)的酶切多態(tài)性是緊密連鎖的。因此,各研究擴(kuò)增片段和所用酶雖不盡相同,但并不影響基因型的判斷。Tsiaras[21]等研究結(jié)果顯示,AB型κ-CN在奶蛋白產(chǎn)量和含量上顯著地高于AA型,而且AB型有更高的產(chǎn)奶量和乳脂量;但是κ-CN對(duì)繁殖性能并沒(méi)有影響。由此在品種的選育過(guò)程中,可選擇對(duì)產(chǎn)奶性狀有利的乳蛋白類型,且不會(huì)對(duì)乳牛的生產(chǎn)繁殖性能產(chǎn)生負(fù)面影響。

表2 牛κ酪蛋白基因分型及與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)研究

關(guān)于κ酪蛋白對(duì)奶酪生產(chǎn)方面影響的報(bào)道也較多。Marziali[22]等報(bào)道BB型κ-CN乳樣中的總固型物質(zhì)、脂肪和蛋白質(zhì)含量最高,是生產(chǎn)奶酪的最理想原料。Eenennaam[23]等通過(guò)凝乳酶水解、PAGE檢測(cè)以及光密度掃描等方法巧妙地揭示出在AB型雜合體牛中,B等位基因κ酪蛋白比A等位基因κ酪蛋白在乳樣中的含量更高,即表明B等位基因可提高乳中κ-CN的表達(dá)。Wedholm等[24]分析顯示凝固性差的和不凝固的乳樣都與低濃度的κ-CN及其在總酪蛋白中所占的比率低有關(guān)。還有,AB型κ-CN牛的乳樣比AA型的有更高的κ-CN濃度,而AB和AE型以及AA和AE型之間則無(wú)顯著差異。此外,他們還提出,酪蛋白在乳蛋白中的高比率顯著地有利于蛋白質(zhì)到奶酪的轉(zhuǎn)化?？傊?眾多研究表明,BB型κ-CN牛乳不僅凝乳時(shí)間短,凝塊硬度大,而且奶酪產(chǎn)量高,極其適合制作奶酪。

4 κ酪蛋白基因影響奶牛性狀表現(xiàn)的可能機(jī)制

乳蛋白變異體之間理化性質(zhì)上的差異可能是由其蛋白質(zhì)組成所引起的,而蛋白質(zhì)組成的不同又是由編碼序列的多態(tài)性決定的。Plowman等[25]研究了含有κ-CN C變異體的牛乳比含有A和B變異體的牛乳凝乳時(shí)間更長(zhǎng)的原因,認(rèn)為是κ-CN C變異體第97位氨基酸His改變了其空間構(gòu)象,從而使它與凝乳酶的結(jié)合不緊密,所以凝乳酶對(duì)其切割比較緩慢。κ-CN A和B變異體之間對(duì)奶酪生產(chǎn)的影響機(jī)理也可能與此類似。

κ酪蛋白基因型與泌乳性狀間的關(guān)聯(lián)性可以用基因調(diào)控區(qū)存在突變位點(diǎn)來(lái)解釋。Schild等[26]分析了7個(gè)牛種13頭奶牛CSN 3 5′側(cè)翼區(qū)約1 kb的序列,發(fā)現(xiàn)15個(gè)單核苷酸替換,有一些位于幾個(gè)可能的調(diào)控蛋白,如 MGF(Mammary Gland Factor)、HNF3(Hepatocyte Nuclear Factor 3)、GR(Glucocorticoid Receptor)、OCT1(Octamer Binding Factor l)、PMF(Pregnancy-specific Mammary Nuclear Factor)、AP2(Activator Protein-2)等的結(jié)合位點(diǎn),認(rèn)為這正是基因表達(dá)有差異的原因。除5′側(cè)翼區(qū)外,3′非編碼區(qū)也可能影響基因的表達(dá)。Debeljak等[27]通過(guò)RT-PCR和毛細(xì)管電泳定量顯示κ-CN AB雜合體中 B轉(zhuǎn)錄本比A轉(zhuǎn)錄本多 13.4%。并且在CSN3的3′-UT R發(fā)現(xiàn)有7個(gè)多態(tài)位點(diǎn),其中2個(gè)接近加尾信號(hào)序列,可能在決定polyA尾的長(zhǎng)度中起重要作用,而polyA尾長(zhǎng)度又會(huì)影響mRNA的穩(wěn)定性。Robitaille等[28]依據(jù)κ-CN B等位基因mRNA在κ-CN總mRNA中所占的比率通過(guò)聚類分析將18頭奶牛分為兩組(組1為50±0.09,組2為56±1.3),然后將其與κ-CN B變異體蛋白質(zhì)在κ-CN總蛋白中所占比率進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果未發(fā)現(xiàn)它們之間有相關(guān)性。因此提出可能是κ-CN非編碼區(qū)存在等位基因多態(tài)位點(diǎn),影響基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)、剪切過(guò)程及mRNA的穩(wěn)定性,從而間接影響κ-CN A、B兩個(gè)等位基因的表達(dá)。

后來(lái),人們又將目光放在了啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(Transcription Factor Binding Sites,TFBS)。在理論上預(yù)測(cè)TFBS即可為以后的功能啟動(dòng)子研究提供最初的定位,又可證實(shí)啟動(dòng)子內(nèi)的功能元件是增強(qiáng)還是抑制基因表達(dá)。Malewski[29]指出κ-CN啟動(dòng)子區(qū)包含以下轉(zhuǎn)錄因子:C/EBP(CCAAT/Enhancer Binding Protein)、CTF/NF1(CCAAT-Binding TranscriptionFactor/Nuclear Factor 1)、MAF(Mammary cell-Activating Factor)、MGF 、PMF 、YY1(Yin and Yang 1),它們中有的對(duì)轉(zhuǎn)錄起誘導(dǎo)作用,有的起抑制作用;有些是通用轉(zhuǎn)錄因子,有些是乳腺特異轉(zhuǎn)錄因子。Debeljak等[30]揭示出κ-CN啟動(dòng)子近側(cè)750 bp區(qū) TFBS的密度比-1 300 bp～-750 bp區(qū)的低,后面區(qū)域內(nèi)反芻動(dòng)物有3個(gè)均勻分布的信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子5(Signal Transducers and Activators of Transcription 5,STAT5)。牛 CSN3的3個(gè) STAT5位于-1 300 nt～-1 000 nt內(nèi),其實(shí)驗(yàn)也證明2 064 bp長(zhǎng)的κ-CN啟動(dòng)子比925 bp長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄效率更高。

也有學(xué)者探究了κ-CN啟動(dòng)子區(qū)與編碼區(qū)之間單倍型的關(guān)系。Kaminski[31]研究證實(shí)κ-CN啟動(dòng)子區(qū)與第4外顯子區(qū)存在基因內(nèi)單倍型,而且與乳蛋白率顯著相關(guān)。Keating等[32]研究了9個(gè)牛品種κ-CN的啟動(dòng)子區(qū),發(fā)現(xiàn)有三個(gè)多態(tài)位點(diǎn),-514,-426和-384(T/G,T/C和T/C),它們之間是連鎖的。同時(shí)他們也對(duì)κ-CN的第4外顯子進(jìn)行了分型,并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)與編碼區(qū)存在明顯的連鎖。雖然這三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)位于 TFBS內(nèi),但是它們對(duì)各項(xiàng)產(chǎn)奶指標(biāo)均無(wú)影響。不過(guò)他們也并不排除κ-CN啟動(dòng)子區(qū)單倍型與影響奶質(zhì)的其他基因存在連鎖的可能性。

5 展望

許多研究成果表明κ-CN基因和與泌乳性能及乳成分之間存在一定的相關(guān)性,但是結(jié)果不盡一致,究其原因可能有以下幾點(diǎn):①所研究的品種及其所處地域不同;②影響奶牛泌乳性狀的各基因之間存在連鎖,有些可能是κ-CN連鎖基因的效應(yīng)而并非它本身的效應(yīng);③不同的調(diào)控元件變異體可與相同的表達(dá)蛋白變異體組成基因內(nèi)單倍型,光研究編碼區(qū)可能得不出正確結(jié)論;④所選擇統(tǒng)計(jì)模型的不同、樣本量差異等人為因素也影響結(jié)果。

基因表達(dá)受不同水平一系列復(fù)雜機(jī)制的控制,如基因激活及轉(zhuǎn)錄起始,mRNA加工與轉(zhuǎn)運(yùn),mRNA的穩(wěn)定性,mRNA的翻譯效率及翻譯后修飾等。基因表達(dá)主要在轉(zhuǎn)錄水平被調(diào)控,但現(xiàn)在對(duì)CSN3轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究還不夠充分,需繼續(xù)深入研究。此外,對(duì)CSN3的研究主要集中在第4外顯子區(qū),還需要對(duì)其它外顯子及內(nèi)含子甚至整個(gè)基因,特別是本文提到的幾處可能調(diào)控區(qū)進(jìn)行深入分析,發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性并揭示它們與產(chǎn)奶性狀之間的關(guān)系。

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