鄭毅雄，張魯清，包 祺，陳 奇，姜 明，陳 力

（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院外科，浙江杭州 310009）

全胃切除的患者常常會(huì)出現(xiàn)傾倒綜合征、反流性食管炎、營(yíng)養(yǎng)不良和貧血等問(wèn)題，使得患者的生活質(zhì)量下降。盡管各種胃替代手術(shù)方法被用于臨床中，但是重建方式的有效性仍頗受爭(zhēng)議。新近的組織工程技術(shù)使得胃腸道的人工再造成為可能，研究表明，利用種子細(xì)胞、支架材料以及相應(yīng)的生長(zhǎng)因子構(gòu)建有生物活性的胃腸道，能夠增加胃腸黏膜吸收面積，改善胃腸道功能[1-2]。因此，利用組織工程技術(shù)在體外形成胃組織進(jìn)行體內(nèi)再植，為解決全胃切除術(shù)后的營(yíng)養(yǎng)吸收問(wèn)題帶來(lái)了希望。

胃腸道平滑肌層對(duì)于胃腸的蠕動(dòng)功能和病理生理機(jī)制具有十分重要的作用。因此，獲取大量高純度的胃腸平滑肌細(xì)胞是胃腸組織工程學(xué)的必要條件。本研究在顯微鏡下分離大鼠胃平滑肌，采用酶消化法獲取平滑肌細(xì)胞，建立穩(wěn)定的胃平滑肌細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)模型，并進(jìn)一步探討其三維復(fù)合培養(yǎng)的可行性，從而為開展相關(guān)的組織工程研究打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要材料

150～200 g SD大鼠由浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，PLGA支架材料由浙江工業(yè)大學(xué)馮杰教授提供，高糖DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司），新生小牛血清（杭州四季青生物技術(shù)研究所），胰蛋白酶（Gibco公司），Ⅰ型膠原酶（Sigma 公司），Tissucol凝血酶和纖維蛋白原（Baxter公司），兔抗鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）單克隆抗體（武漢博士德生物公司），碘化丙啶（PI）（Sigma 公司），二乙酸螢光素（FDA）（Sigma 公司），5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）（Sigma公司），恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus公司），倒置顯微鏡（IX70，Olympus公司），熒光顯微鏡（PROVIS AX70，Olympus公司）。

1.2 大鼠胃平滑肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法

無(wú)菌條件下剪取大鼠胃底，將剪下后的組織立即置于含青、鏈霉素的無(wú)菌Hanks液中，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)反復(fù)漂洗2～3次，在體視顯微鏡下仔細(xì)去除食物殘?jiān)皟?nèi)膜，翻轉(zhuǎn)至外側(cè)，小心地撕去腸系膜，再仔細(xì)地刮去漿膜層，直至余下的組織層在顯微鏡下觀察到呈透明的一層為止。以無(wú)菌的Hanks液沖洗3～4次，用眼科剪細(xì)剪成1 mm3的小塊后加入含0.2%Ⅰ型膠原酶的DMEM培養(yǎng)基3～5 ml，37℃振蕩消化4 h后離心（1000 r/min）1 min，棄上清再加入 0.05%胰蛋白酶37℃消化1 h，待消化液渾濁、組織塊呈絮狀提示消化良好。混懸液經(jīng)過(guò)100目細(xì)胞篩過(guò)濾后再離心（1000 r/min）5 min，棄上清，將沉淀細(xì)胞輕輕吹打混勻后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中半開放培養(yǎng)。一般24 h即可見細(xì)胞貼壁伸展，2～3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)成單層和多層交錯(cuò)的致密細(xì)胞層時(shí)（7 d左右）即可傳代培養(yǎng)。

1.3 平滑肌細(xì)胞的鑒定

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 根據(jù)平滑肌細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)特點(diǎn)和生長(zhǎng)方式。

1.3.2 免疫組化染色鑒定 在進(jìn)行第3代細(xì)胞傳代時(shí)，先將6孔培養(yǎng)皿底部放入蓋玻片，然后接種細(xì)胞于培養(yǎng)皿內(nèi)，使細(xì)胞在蓋玻片上進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，取出細(xì)胞爬片，PBS液清洗后用4℃的純丙酮固定15～30 min，自然晾干。采用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體進(jìn)行免疫組化染色分析。根據(jù)SP免疫組化染色的常規(guī)方法，顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野中染色陽(yáng)性的細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例，大于98%的平滑肌細(xì)胞胞漿棕黃色細(xì)絲為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4 三維PLGA復(fù)合物培養(yǎng)模型的建立

擴(kuò)增的第三代細(xì)胞消化分離前24 h，向培養(yǎng)液中加入14%的BrdU孵育，標(biāo)記細(xì)胞。收集足量的細(xì)胞，離心后制成細(xì)胞懸液，加入纖維蛋白原（1∶2）混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度至25×106/ml，無(wú)菌條件下將消毒的PLGA支架（圓柱型，直徑8 mm，高2 mm）放入裝有細(xì)胞懸液的離心管中，材料充分吸附細(xì)胞懸液后，在PLGA支架中形成200 μl/cm3的細(xì)胞密度。分別在每個(gè)細(xì)胞-PLGA支架上滴上2滴凝血酶，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min，使得細(xì)胞懸液在支架內(nèi)聚合，構(gòu)建成PC-PLGA復(fù)合物，該復(fù)合物轉(zhuǎn)移入含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，進(jìn)行三維培養(yǎng)。每2天換液，7 d和14 d后取出復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 PI/FDA細(xì)胞活性檢測(cè)

取出細(xì)胞-PLGA復(fù)合物，PBS洗2次，加FDA 3 ml，37℃培養(yǎng)箱中染色15 min。PBS清洗2次后，加PI避光條件下室溫染色2 min。PBS清洗后立即于熒光顯微鏡下觀察，不加染色劑的細(xì)胞作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 胃平滑肌細(xì)胞形態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.2%Ⅰ型膠原酶和0.05%胰酶混合裂解后，組織裂解充分均勻，細(xì)胞受損傷輕，接種成功率高。光學(xué)顯微鏡下觀察，一般24 h就能發(fā)現(xiàn)細(xì)胞附壁伸展。以平滑肌細(xì)胞為主的纖維樣細(xì)胞起始可有長(zhǎng)短不一的數(shù)個(gè)細(xì)胞突起，呈短梭形，并相互接觸，細(xì)胞質(zhì)透明，核卵圓形，居中，多數(shù)1個(gè)，少數(shù)多個(gè)，最后細(xì)胞逐漸伸展為梭形；密度低時(shí)細(xì)胞排列常呈網(wǎng)格狀排列，密度高時(shí)局部地方細(xì)胞重疊生長(zhǎng)成多層，局部地方甚至沒(méi)有細(xì)胞長(zhǎng)入，成典型的“峰-谷”樣生長(zhǎng)（圖1）。1周左右細(xì)胞就能生長(zhǎng)到進(jìn)行細(xì)胞傳代的亞融合狀態(tài)，此時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代后12 h細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)正常、生長(zhǎng)迅速，5～6 d后可進(jìn)行下一次傳代。

2.2 免疫組織化學(xué)染色

特異的抗平滑肌α-SMA免疫組織化學(xué)染色后，胞質(zhì)內(nèi)可見與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的纖維細(xì)絲，被染成棕黃色，即平滑肌α肌動(dòng)蛋白絲，細(xì)胞平均陽(yáng)性率≥98%。

2.3 三維PLGA復(fù)合物的觀察

2.3.1 倒置顯微鏡觀察 細(xì)胞接種24 h，細(xì)胞-PLGA復(fù)合物內(nèi)可見均勻的細(xì)胞分布，周邊光線強(qiáng)的部分可見細(xì)胞呈圓形黏附于材料上，顯示了細(xì)胞與材料良好的相容性；中央部分光線較弱，僅見材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖2）。

2.3.2 PI/FDA細(xì)胞活性檢測(cè) 熒光顯微鏡顯示，標(biāo)記的擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞均勻分布于材料中，14 d后細(xì)胞數(shù)目有所減少（圖3A）。PI/FDA細(xì)胞活性檢測(cè)顯示，7 d時(shí)，PLGA支架內(nèi)細(xì)胞均勻分布，90%以上的細(xì)胞顯示綠色熒光，PLGA纖維仍保持完整，未顯示熒光染色。14 d時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)方形或多邊形，存活率仍達(dá)90%左右，部分降解的PLGA被PI染成紅色（圖 3B）。

3 討論

組織工程學(xué)的進(jìn)步為胃替代方法開啟了新的希望，美國(guó)Vacanti研究組在2003年開始報(bào)道從新生的大鼠中分離出胃上皮類器官單位，接種于管狀支架材料上，用于替代成年大鼠的胃[1]，雖然組織學(xué)上觀察到類似胃壁的上皮隱窩細(xì)胞構(gòu)成的囊腔結(jié)構(gòu)，但是這種方法很難在臨床上實(shí)現(xiàn)。其原因是：一方面，上皮類器官單位在體外培養(yǎng)基中存活的時(shí)間很短，最多24～48 h，之后就會(huì)出現(xiàn)退化和死亡；另一方面，構(gòu)建足量的胃復(fù)合物需要取得大量的黏膜組織，在大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床中這是極難達(dá)到的[3]。

隨著對(duì)胃腸壁結(jié)構(gòu)和功能的深入認(rèn)識(shí)，人們發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物腸黏膜上皮是機(jī)體代謝最為活躍的場(chǎng)所，體內(nèi)腸黏膜上皮細(xì)胞的再生和適應(yīng)能力非常強(qiáng)，終生進(jìn)行著不間斷的自我更新[4]；但是，小腸黏膜上皮細(xì)胞以及隱窩干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)存在很大的困難。相反，成熟的平滑肌細(xì)胞在體內(nèi)外可呈現(xiàn)出去分化的潛能，體外培養(yǎng)和擴(kuò)增平滑肌細(xì)胞作為組織工程的種子細(xì)胞是切實(shí)可行的[5-6]。因此，建立簡(jiǎn)單可靠的平滑肌細(xì)胞模型成為胃組織工程研究的基本要求。目前大鼠原代細(xì)胞培養(yǎng)有貼塊法和酶解離法。貼塊法的細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，細(xì)胞純化速度慢，且有一定的局限性。本文對(duì)酶解離法加以改進(jìn)探索了一種比較簡(jiǎn)便的膠原酶聯(lián)合胰酶的解離法，該方法成功地在體外培養(yǎng)了大鼠胃平滑肌細(xì)胞，且能在1～2周內(nèi)獲得原代平滑肌細(xì)胞，還能較快地獲得較大量的種子細(xì)胞用于三維支架培養(yǎng)模型的建立，適合于臨床應(yīng)用研究。

生物支架是構(gòu)建組織工程替代物的另一個(gè)關(guān)鍵因素，本研究采用的組織工程復(fù)合物三維構(gòu)建技術(shù)，已在在成骨組織工程的構(gòu)建中被證明切實(shí)可行[7]。體外三維支架復(fù)合培養(yǎng)模型是將高濃度細(xì)胞接種在具有一定的支架材料上，在模擬體內(nèi)的化學(xué)、物理和生物條件下進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)模擬在體細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及代謝，直接觀察細(xì)胞與生物材料復(fù)合生長(zhǎng)的情況，并能有效地檢測(cè)細(xì)胞的生理功能的變化，有利于了解細(xì)胞與材料的相互作用，有助于組織工程支架材料以及組織工程復(fù)合物的篩選。本文所采用的方法將細(xì)胞包埋于纖維蛋白膠作為細(xì)胞外基質(zhì)，再同支架材料結(jié)合，使得細(xì)胞在支架中均勻分布和黏附[8]。纖維蛋白膠同時(shí)提供一種網(wǎng)狀立體支架，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起到支撐作用，使細(xì)胞能從三維方向與培養(yǎng)液充分接觸，有利于物質(zhì)交換且可以進(jìn)行物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)交換，亦有利于細(xì)胞沿纖維蛋白支架游走和聚集，從而形成特定的組織結(jié)構(gòu)，構(gòu)建的三維復(fù)合具有細(xì)胞分布均勻、提供細(xì)胞外基質(zhì)、塑性容易的優(yōu)點(diǎn)，因而適合在組織工程研究中推廣應(yīng)用。

PI/FDA細(xì)胞活性是檢測(cè)三維復(fù)合物中細(xì)胞活性的可靠方法，細(xì)胞損傷的特征是失去漿膜的完整性。FDA可進(jìn)入活細(xì)胞并被水解成游離熒光和醋酸鹽，游離熒光不可透過(guò)細(xì)胞膜，因而在有活力的細(xì)胞里獲得綠色熒光，而受損的細(xì)胞不顯示綠色熒光。相反，PI可跨越不完整的細(xì)胞膜，使得死亡或凋亡的細(xì)胞獲得紅色熒光。熒光標(biāo)記和PI/FDA檢測(cè)方法可用于體外靜態(tài)培養(yǎng)和體內(nèi)植入時(shí)觀察三維復(fù)合物中細(xì)胞的生理和代謝特征，有助于下一步用于研究三維平滑肌細(xì)胞復(fù)合物替代胃腸功能的評(píng)價(jià)。

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